《動物遺傳學》實驗山東農(nóng)業(yè)大學動科學院主講：姜運良實驗一果蠅唾液腺細胞的染色體一實驗目的

練習果蠅唾液腺的分離方法

掌握唾液腺染色體的制片技術觀察唾液腺染色體的特點二遺傳物質(zhì)發(fā)現(xiàn)的歷史19世紀60年代——孟德爾定律（遺傳單位）19世紀80年代——染色體1903年——同源染色體1909－1911年——交換or遺傳重組1911年——染色體圖譜1944－1952年——DNA（遺傳物質(zhì)）1953年——DNA雙螺旋三實驗原理1933年，美國德州大學的Thoephiluspainter在某些昆蟲細胞中發(fā)現(xiàn)了巨大染色體雙翅目昆蟲（果蠅）幼蟲期的唾液腺細胞很大，其中的染色體稱唾液腺染色體，比一般的普通染色體的100－150倍，又稱巨大染色體。在幼蟲發(fā)育過程中，這些細胞停止有絲分裂，但唾液腺染色體仍然進行復制，產(chǎn)生多線染色體。多線染色體經(jīng)染色后，出現(xiàn)深淺不一、寬窄不同的帶，這些帶的數(shù)目和位置是恒定的，代表著果蠅等昆蟲的種的特征。如果染色體缺失、重復、到位、易位等，很容易在唾腺染色體上識別出來。四、實驗材料和用品實驗材料黑腹果蠅的三齡幼蟲實驗用品顯微鏡、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片、濾紙。

E－生理鹽水、1％醋酸洋紅。五、實驗步驟載玻片置于顯微鏡下，上面滴加一滴生理鹽水，放上果蠅幼蟲，兩手各拿一枚解剖針，左手解剖針按住幼蟲的后端1/3,右手解剖針按住頭部用力后拉，把頭部從身體拉出，唾液腺隨之而出。（一對雙叉形透明的囊狀腺體）。除去幼蟲其他組織部分，把唾液腺周圍的脂肪剝離干凈，然后將唾液腺移到干凈的滴有醋酸洋紅的載玻片上。染色10分鐘，蓋上蓋玻片，用濾紙輕壓一下吸去多余的染色液后放在桌子上，用大拇指用力，并橫向揉幾次（勿使蓋玻片移動）。顯微鏡觀察，先在低倍鏡下觀察，找到分散好的染色體圖像，再高倍鏡觀察，畫圖。五、實驗步驟載玻片滴生理鹽水→放幼蟲→用解剖針將頭部和身體拉開→找到唾液腺并將其剝離干凈→轉(zhuǎn)移到有一滴醋酸洋紅的載玻片上→10min→蓋蓋玻片→壓片→觀察六：作業(yè)

實驗報告分組值日顯微鏡放回原位

實驗二PCR擴增和瓊脂糖電泳檢測一、實驗目的學習和掌握PCR擴增及瓊脂糖電泳的基本原理和方法。二、實驗原理多聚酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）的原理類似于DNA的天然復制過程。在待擴增的DNA片段兩側(cè)設計寡核苷酸引物，經(jīng)變性（94℃）、退火（45~68℃）和延伸（72℃）若干個循環(huán)后，DNA擴增2n倍。所使用的酶為耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）。瓊脂糖是D-和L-半乳糖殘基通過α（1→3）和β（1→4）糖苷鍵交替構(gòu)成的線狀聚合物根據(jù)濃度的不同，瓊脂糖凝膠可以構(gòu)成一個直徑從50nm到略大于200nm的三維篩孔的通道。將DNA加到凝膠的負極，在電場的作用下，將不同大小的片段分開三、儀器、材料與試劑儀器

PCR熱循環(huán)儀瓊脂糖凝膠電泳及檢測系統(tǒng)材料與試劑雞基因組DNAdNTPs（10mmol/L）上下游引物（濃度10μmol/L）rTaq酶（5U/μL）DL2000DNAMarkerMgCl2（25mM）10×PCR緩沖液滅菌雙蒸水1.5%瓊脂糖（含EB，注意致癌）電泳緩沖液，上樣緩沖液。四、實驗步驟PCR擴增反應體積（20μl），在0.2mlEppendorf中依次加樣：

10×PCRbuffer2.0μlMgCl21.6μl

dNTPs1.6μl

上游引物0.5μl（10μmol/L）下游引物0.5μl（10μmol/L）

DNA1.0μlddH2O12.6μl

rTaq0.2μl

PCR擴增反應條件：

94℃3min，94℃30s，58℃30s，72℃40s（循環(huán)28次），72℃10min在PCR擴增儀上進行擴增。四、實驗步驟瓊脂糖凝膠電泳配制1.5%瓊脂糖凝膠，取5μlPCR擴增產(chǎn)物+1μl上樣緩沖液電泳。DNA帶負電荷，電泳時DNA從負極向正極泳動。待泳動至凝膠的1/2~2/3位置時，停止電泳，紫外檢測儀下觀察。四、實驗步驟五、作業(yè)寫出實驗的過程并描述你所觀察到的結(jié)果實驗三限制性片段長度多態(tài)性一實驗目的學習和掌握限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）遺傳標記的基本原理和檢測方法二實驗原理

第一代分子遺傳標記RFLP是根據(jù)不同品種（個體）基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點堿基發(fā)生突變，或酶切位點之間發(fā)生了堿基的插入、缺失、重排等，導致酶切片段大小發(fā)生了變化，這種變化可以通過PCR及瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從而可比較不同品種（個體）的DNA水平的差異（即多態(tài)性），RFLP已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及生物進化和分類的研究。三儀器、材料與試劑儀器：電熱恒溫水浴鍋，瓊脂糖凝膠電泳及檢測系統(tǒng)材料與試劑：HindⅢ

限制性內(nèi)切酶，10×MBuffer，待分析的PCR產(chǎn)物，DL2000DNAMarker，6×LoadingBuffer,滅菌雙蒸水,1.5%瓊脂糖（注意：含溴化乙錠EB，致癌，請帶手套操作），電泳緩沖液，上樣緩沖液。四實驗步驟HindⅢ

限制性內(nèi)切酶酶切

反應體積（10μl），在0.2mlEppendorf中依次加樣：

10xbuffer1.0μL

ddH2O5.5μL

HindⅢ0.5μLPCR產(chǎn)物3.0μL

37℃水浴消化2h，消化產(chǎn)物全部用于瓊脂糖檢測。四實驗步驟瓊脂糖凝膠電泳配制1.5%瓊脂糖凝膠，取10μl酶切產(chǎn)物+1μl上樣緩沖液,180V恒壓電泳。DNA帶負電荷，電泳時DNA從負極向正極泳動。待泳動至凝膠的1/2~2/3位置時，停止電泳，紫外檢測儀下觀察。五作業(yè)寫出本實驗的具體操作過程并描述你所觀察到的結(jié)果。實驗四減數(shù)分裂的觀察實驗目的

掌握花粉母細胞染色體制片技術了解減數(shù)分裂各時期染色體的變化特征實驗原理減數(shù)分裂是性母細胞在形成配子時發(fā)生的一種特殊的細胞分裂方式，細胞連續(xù)進行兩次分裂，而染色體只進行一次復制。結(jié)果產(chǎn)生的細胞中染色體數(shù)目只含有原來的一半。兩次分裂均包括前期、中期、后期和末期，其中前期Ⅰ細分為細線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期等5個時期。實驗材料、器具及試劑

大蔥花穗鑷子、載玻片、蓋玻片、解剖針、吸水紙、大培養(yǎng)皿、立式染缸、酒精燈、量筒、顯微鏡。無水乙醇、冰醋酸、洋紅、甘油、松香石蠟。實驗步驟

1、取材；

2、固定：1