抗體，抗體的多樣性及其產(chǎn)生機(jī)制INSTITUTEFORIMMUNOBIOLOGYDEPARTMENTOFIMMUNOLOGY高波

2014-10-09gaobo@整理課件抗體研究簡(jiǎn)史整理課件20世紀(jì)有關(guān)抗體研究獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)的免疫學(xué)家年代學(xué)者姓名國(guó)家獲獎(jiǎng)成就1901E.A.Behring德國(guó)發(fā)現(xiàn)抗毒素，開創(chuàng)免疫血清療法1908P.Ehrlich德國(guó)提出體液免疫理論和抗體生成的側(cè)鏈學(xué)說(shuō)1960F.M.Burnet澳大利亞提出抗體生成的克隆選擇學(xué)說(shuō)1972G.M.Edelman美國(guó)闡明抗體的本質(zhì)R.R.Porter英國(guó)闡明抗體的化學(xué)結(jié)構(gòu)整理課件20世紀(jì)有關(guān)抗體研究獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)的免疫學(xué)家年代學(xué)者姓名國(guó)家獲獎(jiǎng)成就1984N.Jerne丹麥提出天然抗體選擇學(xué)說(shuō)和免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)G.Kohler德國(guó)建立雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體C.Milstein阿根廷單克隆抗體技術(shù)及免疫球蛋白基因表達(dá)的遺傳調(diào)控1987Tonegawa日本闡明抗體多樣性的遺傳基礎(chǔ)整理課件EmilvonBehring,1901,antitoxinsGeoregesKohlerandCesarMilstein,1984,monoclonalantibodySusumuTonegama,1987,structureofIggeneGeraldEdelmanandRodneyPorter,1972,structureofantibodyPaulEhrlich,1908,productionofantibodyNobelPrizewinnersBurnet,1960，ClonalselectionJerne,1984,Idiotypenetwork整理課件抗體——生物體最奇妙的分子無(wú)限的多樣性（diversity)功能與結(jié)構(gòu)的雙重性可變區(qū)——抗原結(jié)合(特異性specificity)

恒定區(qū)——生物學(xué)效應(yīng)功能分泌型和膜型表達(dá)整理課件B細(xì)胞接受抗原刺激后增殖分化成漿細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白?；靖拍預(yù)g1Ab1Ag1-Ab1Ag2Ag2Ag2-Ab2與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合。主要存在于血清中。整理課件EmilvonBehring(1845-1917)抗毒素（1888）凝集素（1896,GruberandDurham）沉淀素（1897,kraus）抗體(antibody)是介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子，是B細(xì)胞接受抗原刺激后增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白。抗體一詞的由來(lái)（19世紀(jì)末）整理課件1937年Tiselius和Kabat用電泳方法證實(shí)抗體的活性存在于泳動(dòng)最慢的血清組分，稱為球蛋白抗體與球蛋白關(guān)系抗體≠球蛋白整理課件1968和1972年WHO和國(guó)際免疫學(xué)會(huì)分別決定將具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白統(tǒng)稱為免疫球蛋白.抗體與免疫球蛋白關(guān)系抗體免疫球蛋白功能概念結(jié)構(gòu)概念整理課件一、基本概念B細(xì)胞接受抗原刺激后增殖分化成漿細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合主要存在于血清中又稱免疫球蛋白(Immunoglobulin)分泌型sIg、膜型mIg整理課件1）四肽鏈通過(guò)鏈間二硫鍵組成H2L2重鏈：五類(isotype:a、g、m、d、e)輕鏈：兩型(k、l)一、基本結(jié)構(gòu)VHCH1CH2CH3CH4VLCLFabHingeregionFcCOO–NH3+免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)整理課件RodneyPorter1917-1985NobelPrizein1972GeraldEdelman1929--NobelPrizein1972整理課件FabFabFcPorter主要致力于將抗體中負(fù)責(zé)與外來(lái)抗原結(jié)合的部分從抗體中分開，他發(fā)現(xiàn)可利用酵素--木瓜蛋白(papain)，將抗體分成三部分。HHLLEdelman將抗體分子假定與其它各種蛋白質(zhì)一樣，由一些polypeptide鏈所構(gòu)成，而他認(rèn)為polypeptide鏈間最可能以二硫鍵結(jié)合在一起，故他試圖將這些鍵結(jié)打斷來(lái)觀察其中的各條polypeptide鏈，結(jié)果他發(fā)現(xiàn)這些氨基酸鏈單獨(dú)存在時(shí)都不具有任何抗體的功用。整理課件重鏈（Heavychain:H鏈）①大約500a.a,糖基(+)②類別（Class）:H鏈：,,,,.(Ig)IgA,IgG,IgMIgD,IgE

輕鏈（lightchain:L鏈）①大約214a.a,糖基(-)②型別（type）:,重鏈和輕鏈（Heavy&lightchains）VHCH1CH2CH3CH4VLCLFabHingeregionFcCOO–NH3+整理課件可變區(qū)(Variableregion,VH/VL,Fv)：結(jié)合抗原

VH和VL：高變區(qū)HVR－抗原結(jié)合部位－互補(bǔ)決定區(qū)CDR

骨架區(qū)FR1－4(1971,Kabat)

恒定區(qū)(Constantregion,CH/CL)

絞鏈區(qū)(Hingeregion)Thebasicstructureofimmunoglobulins三個(gè)功能區(qū)(Domain)整理課件

0102030405060708090100110120130140150160170180190200210220

5040

302010

0CDR1CDR2CDR3

抗體分子的多樣性Igl

鏈的氨基酸序列酸殘基的變異率相應(yīng)位置上氨基對(duì)來(lái)自不同B細(xì)胞克隆的Ig輕鏈氨基酸序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)V區(qū)的變化主要集中在3個(gè)分別由6－10個(gè)氨基酸殘基組成的狹小區(qū)域內(nèi)。這3個(gè)區(qū)又被稱作高可變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)（CDR），參與抗原結(jié)合部位的組成。整理課件

0102030405060708090100110120130140150160170180190200210220

5040302010

0

CDR1CDR2CDR3

抗體分子的多樣性酸殘基的變異率相應(yīng)位置上氨基DiversityandSpecificity整理課件整理課件抗原B細(xì)胞表位

抗體CDR表位AbAg整理課件鉸鏈區(qū)（Hingeregion）VHCH1CH2CH3CH4VLCLFabHingeregionFcCOO–NH3+特點(diǎn)：1)極富彈性2)富含脯氨酸功能:1)有利于Ab與Ag的結(jié)合2)有利于Ab與補(bǔ)體的結(jié)合整理課件IgG分子結(jié)合抗原前后的構(gòu)象變化Fab段Fc段C1q結(jié)合位點(diǎn)被屏障結(jié)合抗原之前CH1CH2暴露的C1q結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合抗原之后整理課件結(jié)構(gòu)域1）Ig分子中由鏈內(nèi)二硫鍵構(gòu)成的致密立體球體(V/C/H)。

2）b-sheet、b-barrel、immunoglobulinfold。

3）CDRs(Hypervariableregions)、FRs(Frameworkregions)。整理課件免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)功能區(qū)整理課件“Ig-likeDomain(Ig樣結(jié)構(gòu)域)”整理課件二、免疫球蛋白的其他成分(1)化學(xué)本質(zhì)：漿細(xì)胞分泌的多肽鏈JCHAIN

IgAdimer(2)存在：IgM（五聚體）,sIgA（雙體）IgM連接鏈（joiningchain，J鏈）SecretorypieceJoiningchain整理課件

SPIgAdimer分泌片（SecretoryPiece，SP)(1)化學(xué)本質(zhì)：多肽鏈(70kD)(2)來(lái)源：上皮細(xì)胞J

chain（3）作用：

a.幫助IgA穿越黏膜

b.保護(hù)sIgA抵抗蛋白酶的水解作用整理課件SecretoryIgA(sIgA)PlasmacellsIgAdimerpIgRSPEpithelialCell整理課件胃蛋白酶木瓜蛋白酶FcpFcF(ab′)2Fab

三、免疫球蛋白的水解片段木瓜蛋白酶作用于IgG分子重鏈間二硫鍵的N端側(cè)，將其裂解為Fab段和Fc段。胃蛋白酶則切在該二硫鍵之C端側(cè)，產(chǎn)生F(ab’)2和pFc段。整理課件類(Class):重鏈C區(qū)抗原性 IgG、IgA、IgM、IgD、IgE亞類(Subclass):重鏈抗原性/二硫鍵數(shù)目位置 IgG1-4型(Type):輕鏈C區(qū)抗原性 k、l亞型(Subtype):輕鏈C區(qū)aa差異排列

l1～4免疫球蛋白的異質(zhì)性免疫球蛋白的類型整理課件血清型免疫球蛋白既可結(jié)合抗原，又可作為抗原，激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，因而也是一類抗原物質(zhì)。由于免疫球蛋白的遺傳基礎(chǔ)不同，不同的免疫球蛋白的抗原性也有差異。利用血清學(xué)方法測(cè)定和分析免疫球蛋白抗原性予以分類，稱為免疫球蛋白的血清型。整理課件1、同種型(isotype)：同一種屬所有個(gè)體免疫球蛋白分子共同的抗原特異性標(biāo)志。由C區(qū)決定。VHCH1CH2CH3CH4VLCLFabHingeregionFc整理課件2、同種異型（allotype)：同一種屬不同個(gè)體間免疫球蛋白分子所具有的不同的抗原特異性標(biāo)志。由鏈、鏈、鏈、鏈C區(qū)決定。VHCH1CVLCLFabHingeregionFc整理課件3、獨(dú)特型(idiotype,Id)：每個(gè)免疫球蛋白分子所特有的抗原特異性標(biāo)志。由超變區(qū)特殊的氨基酸序列及其構(gòu)型決定。VHCH1CH2CH3CH4VLCLFabHingeregionFc整理課件1）與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合：Fv2）激活補(bǔ)體：3）結(jié)合FcR：促吞噬(opsonization)

介導(dǎo)過(guò)敏介導(dǎo)細(xì)胞毒(ADCC)

免疫調(diào)理 4）穿過(guò)胎盤和粘膜5）調(diào)節(jié)免疫功能VHCH1CH2CH3CH4VLCLFabFcCOO–NH3+免疫球蛋白的功能整理課件整理課件免疫球蛋白的功能a.整理課件b.免疫球蛋白的功能整理課件

FcR

Antibody-DependentCell-mediatedCytotoxicity(抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用)TargetcellAbEffectorcellTargetcell表達(dá)Fc受體的組織細(xì)胞(NK、M、中性粒細(xì)胞）通過(guò)識(shí)別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的的靶細(xì)胞。ADCC免疫球蛋白的功能整理課件抗體的抗病毒效應(yīng)NK靶細(xì)胞介導(dǎo)ADCC經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體C1qr2s2調(diào)理吞噬作用免疫球蛋白的功能整理課件IgGIgMIgAIgEIgD各類免疫球蛋白的特點(diǎn)和功能整理課件出生后3個(gè)月開始合成，3～5歲接近成人含量最多占血清總Ig的75%產(chǎn)生比較晚，是再次應(yīng)答的主要抗體半衰期最長(zhǎng)(t

?

=23天)分布最廣，血管外的主要抗體唯一能通過(guò)胎盤的Ig激活補(bǔ)體–IgG1～3（經(jīng)典），IgG4（替代）結(jié)合細(xì)胞–巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞——調(diào)理作用

NK細(xì)胞，巨噬細(xì)胞——介導(dǎo)ADCC

結(jié)合SPA—協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)特性：IgG整理課件IgG功能：抗感染的主要抗體

介導(dǎo)II,III型超敏反應(yīng)介導(dǎo)自身免疫

調(diào)理介導(dǎo)ADCC

固定補(bǔ)體中和病毒和毒素

抗菌抗病毒抗外毒素整理課件IgG四個(gè)亞類的特點(diǎn)IgG1IgG2IgG3IgG4血清含量(占IgG的百分比）702064

血清半衰期(天)2323723通過(guò)胎盤++++++++++固定補(bǔ)體+++++–

結(jié)合Fc受體+++–++++整理課件

特性血清中含量第三出現(xiàn)最早的Ig分布局限，主要在血管內(nèi)d)通過(guò)經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體e)分子量最大f)凝集細(xì)菌e)結(jié)合細(xì)胞–

巨噬細(xì)胞,單核細(xì)胞-調(diào)理

NK細(xì)胞,巨噬細(xì)胞-介導(dǎo)ADCC

IgMJ鏈

整理課件IgM抗感染的先鋒抗體

介導(dǎo)II,III型超敏反應(yīng)介導(dǎo)自身免疫天然血型抗體

調(diào)理作用

(最強(qiáng))

激活補(bǔ)體中和病毒和外毒素凝集微生物介導(dǎo)ADCC功能：

抗菌作用最強(qiáng)

(500—1000×IgG)

抗病毒抗外毒素整理課件IgA特點(diǎn):血清中含量第二

(血清型IgA，serumIgA)主要以分泌型存在(外分泌液中）.(secretoryIgA,sIgA)

sIgA通過(guò)初乳被動(dòng)轉(zhuǎn)移給新生兒

唾液,

眼淚,乳汁,

鼻黏膜,

支氣管分泌液,

生殖道分泌物,

前列腺液,

小腸黏膜分泌液.

SCJchainIgAdimer整理課件sIgA功能：粘膜局部抗感染的主要抗體

阻止病原體粘附于粘膜細(xì)胞中和病毒和外毒素

傷寒沙門氏桿菌,

奈瑟氏淋球菌

脊髓灰質(zhì)炎病毒，流感病毒

抗菌作用抗病毒作用抗外毒素作用整理課件IgD分子的結(jié)構(gòu)IgD分子*在膜表面的表達(dá)是B細(xì)胞成熟的主要標(biāo)志；*膜型IgD作為BCR的組成部分，發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)作用整理課件整理課件StructureofIgEmoleculeIgE特性1)含量最少2)與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的FcR受體結(jié)合親細(xì)胞性抗體:不與Ag結(jié)合，即可與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的FcR牢固結(jié)合3)不能激活補(bǔ)體整理課件IgE①參與過(guò)敏反應(yīng)(I型超敏反應(yīng))

結(jié)合肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞導(dǎo)致各種生物活性的介質(zhì)的釋放嗜酸性粒細(xì)胞有IgE的FcR，嗜酸性粒細(xì)胞通過(guò)此受體結(jié)合包被在蠕蟲上的IgE的Fc段，最終殺死寄生蟲②抗寄生蟲感染作用整理課件人抗體分子的特性抗體類別IgGIgAIgMIgDIgE重鏈類別gamde重鏈亞類g1,g2,g3,g4a1,a2輕鏈類別k和

lk和

lk和

lk和

lk和

l分子式g2l2

或g2k2a2l2或(a2l2)5SCJa2k2或(a2k2)5SCJ(m2l2)5J或(m2k2)5Jd2l2

或d2k2e2l2

或e2k2分子量（kDa）150160或400900180190固定補(bǔ)體能力+0++++00血清濃度(mg/100ml)100020012030.05血清半衰期(天)236532穿過(guò)胎盤＋0000肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞脫顆粒？000++++裂解細(xì)菌能力+++++??抗病毒能力+++++??整理課件2014-10-13整理課件抗體的多樣性及其產(chǎn)生機(jī)制抗體的多樣性抗體的多樣性產(chǎn)生的機(jī)制抗體的類別轉(zhuǎn)換整理課件1897年 PaulEhrlich提出側(cè)鏈學(xué)說(shuō)1930年 Haurowitz提出直接模板學(xué)說(shuō)1941年 Pauling提出間接模板學(xué)說(shuō)1955年 NielsJerne提出自然選擇學(xué)說(shuō)1958年 FMBurnet提出克隆選擇學(xué)說(shuō)抗體生成理論的發(fā)展史整理課件整理課件（一）抗體的多樣性抗體/免疫球蛋白的基因結(jié)構(gòu)抗體基因的重排抗體基因的重排機(jī)制整理課件抗體的多樣性早期假說(shuō)一：生殖細(xì)胞學(xué)說(shuō)抗體的多樣性早期假說(shuō)二：體細(xì)胞突變學(xué)說(shuō)The

genomecontainsmanylociencodingantibodymolecules.Bcellexpressoneoftheseloci.DifferentBcellsexpressdifferentloci.ThereareasmallnumberofantibodygeneswhichundergomutationastheBcellmatures,thusgivingrisetoBcellsexpressingantibodyofdifferentspecificity.整理課件1971年Kabat基因嵌入模型利根川進(jìn)：抗體的基因重排理論整理課件免疫球蛋白的基因結(jié)構(gòu)整理課件整理課件整理課件Inheavychains,theV,DandJsegmentsencodethevariabledomainwhiletheCsegmentencodestheconstantdomain.Inlightchains,theVandJsegmentsencodethevariabledomainwhiletheCsegmentencodestheconstantdomain.整理課件抗體基因的重排整理課件DuringBcellmaturation,immunoglobulingenesundergorearrangement.整理課件DuringBcellmaturation,immunoglobulingenesundergorearrangement.整理課件DuringBcellmaturation,immunoglobulingenesundergorearrangement.整理課件DuringBcellmaturation,immunoglobulingenesundergorearrangement.整理課件Thekappaandlambdalociundergosimilarrearrangement.SincetherearenoDsegments,thereisasingleV-->Jrearrangement.Inbothheavyandlightchainrearrangement,anumberofJsegmentsmayremainbetweentheV(D)andCsegments.TheseareincludedintheRNAtranscriptbutaresplicedoutduringRNAprocessing.ThefinallightchainmRNAcontainsoneVJCunit.KubyFigure5-4整理課件KubyFigure5-4整理課件整理課件抗體基因重排的機(jī)制整理課件（1）重組信號(hào)序列(recombinationsignalsequence,RSS)在VH和VL基因3’端、J基因5’端和D基因兩端有高度保守的核苷酸序列，包括一個(gè)7核苷酸組成的七聚體(heptamer)和一個(gè)9核苷酸組成的九聚體(nonamer)，兩者間隔121或231個(gè)核苷酸，稱為RSS。整理課件只有間隔12個(gè)堿基對(duì)和間隔23個(gè)堿基對(duì)的RSS之間發(fā)生重組，而間隔長(zhǎng)度相等的RSS之間不發(fā)生重組，這就是12/23堿基對(duì)規(guī)律(12/23basepairrule)，也叫做1+2圈規(guī)律(1+2turnrule)。整理課件KubyFigure5-3整理課件Recombinationsignalsequences-conservedsequencesinregionsjustupstreamordownstreamofgenesegments.Consistofaconservedheptamerandnonamerwitha12or23bpspacer.KubyFigure5-3整理課件Theone-turn/two-turnrule(12/23rule)-recombinationoccursonlybetweenasegmentwitha12bpspacerandasegmentwitha23bpspacer.RecombinationSignalSequencesDirectRecombination整理課件RecombinationActivatingGenes(encodeRAG-1andRAG-2)RAG-1andRAG-2mediaterecognitionofsignalsequencesandrearrangementofDNAsegments.MicedeficientinRAG-1orRAG-2areunabletorearrangeheavyorlightchaingenes.ThesemicehavenomatureBcells.-->BcellswillnotmatureiftheycannotexpressaBCR.（2）重組活化基因RecombinationActivatingGenes整理課件RAG-deficientmicealsolackmatureTcells.-->TheTcellreceptorisalsoencodedbylocicontaininggenesegmentsthatmustberearrangedbeforetheTCRcanbeexpressed.TcellswillnotmatureiftheycannotexpressaTCR.SCID(severecombinedimmunedeficency)micealsohaveadefectthataffectsrearrangementofBCRandTCRloci.TheyalsohavenomatureTorBcells.整理課件Flowcytometryofnormalvs.RAG-1deficientmice:LymphnodecellsFITCanti-CD19(Bcellmarker)andPEanti-CD3(Tcellmarker)NormalmiceRAG-1-deficientmice整理課件HowrecombinationintheVregionsofantibodyhappens?整理課件整理課件整理課件整理課件AGCTTATA整理課件Terminaldeoxynucleotidyltransferase(Tdt)Anenzymethatrandomlyaddsinnucleotidesduringjoiningofheavychain(NOTlightchain)segments.整理課件ReadKubypages113-115:GeneSegmentsAreJoinedbyRecombinases整理課件ProductiveandnonproductiverearrangementsJoiningofsegmentsisnotpreciseandmayresultinlossofthecorrectreadingframe.Thismayleadtointroductionofstopcodons-->nonproductiverearrangements.整理課件RSSRSSRSS:recombinationsignalsequenceRAG:recombinationactivatinggene整理課件P-核苷酸和N-核苷酸的加入片段斷端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)TCAGDTAATJ內(nèi)切酶切開發(fā)夾結(jié)構(gòu)產(chǎn)生P-核苷酸TCGADATATJTdT酶加入N-核苷酸TCGACTCDGAGCGATATJ通過(guò)DNA修復(fù)，斷端連接，恢復(fù)雙鍵結(jié)構(gòu)TCGACTCGCTATAAGCTGAGCGATATDJPNP整理課件Twoallelesareavailableateachlocus(maternalandpaternal).ABcellexpressesonlyoneheavyandlightchainallele.

-ALLELICEXCLUSION整理課件First,onealleleoftheheavychainisrearranged.Iftherearrangementissuccessful,theotherallelewillnotberearranged.Iftherearrangementisnonproductive,theotherallelewillberearranged.Onceaheavychainallelerearrangementisproductive,lightchainrearrangementwillbegin.Ifrearrangementofbothheavychainallelesisnonproductive,theBcellwillnotmaturefurtherbutwilldieofapoptosiswithinthebonemarrow.整理課件Ifaheavychainalleleissuccessfullyrearranged,lightchainrearrangementbegins.Inhumans,thekappalocusisrearrangedfirst.Rearrangementoccursatonealleleatatimeandcontinuesuntilaproductiverearrangementoccurs.Ifbothkappaallelesrearrangenonproductively,rearrangementwillbeginatthelambdalocus.Ifall4alleles(bothkappaallelesandbothlambda