質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控機制

07級細(xì)胞專業(yè)

周鵬1整理ppt主要內(nèi)容質(zhì)粒的自主??復(fù)制性質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控機制質(zhì)粒不相容性(inc,incompatibility)2整理ppt質(zhì)粒(plasmid)質(zhì)粒是能獨立于寄主染色體而自主復(fù)制并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型目前已知只有酵母殺傷質(zhì)粒(killerplasmid)是RNA型絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒為共價、閉合、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA(covalentlyclosecircularDNA

)質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-200kb3整理ppt一質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制,并賦予宿主細(xì)胞特定的遺傳性狀.質(zhì)粒DNA的復(fù)制方式:主要有“θ”型復(fù)制和滾環(huán)復(fù)制根據(jù)在每個細(xì)胞中拷貝數(shù)的多寡，質(zhì)粒可分為兩大復(fù)制類型：①嚴(yán)緊型質(zhì)粒(Stringentplasmid)②松弛型質(zhì)粒(Relaxedplasmid)

一種質(zhì)粒究竟是屬于嚴(yán)緊型還是松弛型并不是絕對的，同一質(zhì)粒在不同的宿主細(xì)胞中可能具有不同的復(fù)制型，這說明質(zhì)粒的復(fù)制不僅受自身的制約，同時還受到宿主的控制，同宿主的狀況有關(guān)。

4整理ppt質(zhì)粒復(fù)制類型嚴(yán)緊型質(zhì)粒(Stringentplasmid)

松弛型質(zhì)粒(Relaxedplasmid)

拷貝數(shù)少(1～3個拷貝數(shù))多(10～60個拷貝數(shù))分子量較大較小復(fù)制方式隨細(xì)菌染色體的復(fù)制同步進(jìn)行，即只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時質(zhì)粒也只復(fù)制一次獨立于細(xì)菌染色體而自主復(fù)制,即在整個細(xì)胞周期中隨時可以復(fù)制，當(dāng)染色體復(fù)制已經(jīng)停止時，該質(zhì)粒仍然能夠繼續(xù)復(fù)制。控制系統(tǒng)單拷貝控制系統(tǒng)多拷貝控制系統(tǒng)常見質(zhì)粒F質(zhì)粒,

P1質(zhì)粒

ColE1質(zhì)粒(20～30)

;pBR322(16copies);pUC(30～50copies)

5整理ppt二質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控機制

為與宿主穩(wěn)定地共存并把代謝負(fù)擔(dān)減至最低,質(zhì)粒必須控制自身的復(fù)制。在一定的生長條件下、在一定的宿主菌中,某一質(zhì)粒的拷貝數(shù)(N)通常是一定的。負(fù)調(diào)控模型質(zhì)粒剛移入新宿主時,負(fù)調(diào)節(jié)因子的濃度可忽略不計,質(zhì)粒能在短時間內(nèi)達(dá)到正?？截悢?shù),然后通過增加或減少每細(xì)胞周期每質(zhì)?？截惖膹?fù)制率來調(diào)節(jié)細(xì)胞中的質(zhì)粒拷貝數(shù)(N),使該菌群中各細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)維持在平均值(Nav)附近的一個很小的波動范圍內(nèi)。上述控制機制是由質(zhì)粒自編碼的負(fù)控制系統(tǒng)通過調(diào)控復(fù)制起始率而實現(xiàn)的,其負(fù)控制元件就編碼在質(zhì)粒上。6整理ppt現(xiàn)在已知的復(fù)制控制方式主要有三類:⑴單一元件控制;⑵主、輔元件控制;⑶2種控制元件協(xié)同作用。依所用負(fù)控制元件的類型不同,質(zhì)粒復(fù)制的控制系統(tǒng)主要有:⑴重復(fù)子結(jié)合調(diào)控(iteron-bindingregulation)⑵抑制物-靶位調(diào)控(ihibitor-targetregulation)①反義RNA單獨控制②反義RNA與轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白共同控制7整理ppt⒈重復(fù)子結(jié)合調(diào)控(iteron-bindingregulation)

在含重復(fù)子的質(zhì)粒復(fù)制起點(ori)中,有一富AT區(qū)和多個重復(fù)序列(重復(fù)子),質(zhì)粒編碼的復(fù)制起始蛋白Rep能以有序的方式與重復(fù)子序列結(jié)合,起到控制質(zhì)?？截悢?shù)的作用。

在上述模式中,Rep蛋白結(jié)合在復(fù)制起始區(qū)及其附近的重復(fù)序列上,對復(fù)制起始起著正調(diào)節(jié)作用,同時對其自身的表達(dá)起負(fù)調(diào)節(jié)作用。8整理pptRegulationofplasmidcopynumberbyiterons:

Rep蛋白能以二體形式結(jié)合于啟動子區(qū),反式作用,對其合成進(jìn)行自我調(diào)節(jié);Rep蛋白對復(fù)制具有雙向調(diào)控作用,且視它的胞內(nèi)濃度而定,當(dāng)胞內(nèi)濃度低時起復(fù)制激活劑作用,胞內(nèi)濃度高時則起抑制劑作用?！笆咒D”模型(“handcuffing”model)9整理ppt空間位阻模型空間位阻模型認(rèn)為,決定質(zhì)粒復(fù)制率的主要因素是重復(fù)子的濃度而不是Rep蛋白的表達(dá)水平。當(dāng)質(zhì)粒拷貝數(shù)較低時,Rep蛋白與重復(fù)子結(jié)合并飽和,促發(fā)復(fù)制起始;隨著質(zhì)?？截悢?shù)的增加,結(jié)合于某一起點重復(fù)子的Rep分子,開始與結(jié)合于另一起點重復(fù)子的Rep分子相互作用,并通過Rep-Rep相互作用把2個環(huán)狀質(zhì)粒分子偶聯(lián)起來,形成“手銬”狀的復(fù)合物,導(dǎo)致這2個重復(fù)子區(qū)域之間出現(xiàn)空間位阻而阻斷復(fù)制的起始。在隨后的細(xì)胞生長期間,這種質(zhì)粒對也逐漸分離,使各質(zhì)粒分子的復(fù)制起始潛力得以恢復(fù)。10整理ppt⒉抑制物-靶位調(diào)控

(ihibitor-targetregulation)在這一模式中,由質(zhì)粒編碼的抑制因子(反義RNA)結(jié)合在復(fù)制起始區(qū)的特定靶位點上,對復(fù)制起負(fù)調(diào)控作用。反義RNA:小RNA分子,長35～150nt,有1～4個莖-環(huán)(stem-loop),其序列與靶轉(zhuǎn)錄物5'端的一個區(qū)域互補,又稱反轉(zhuǎn)錄RNA(countertranscribedRNA,ctRNA)反義RNA的作用方式主要有以下兩種:⑴抑制引物RNA加工(以ColE1質(zhì)粒為例來說明)⑵抑制前導(dǎo)肽翻譯(以R1質(zhì)粒為例來說明)

11整理ppt⑴抑制引物RNA加工ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起始由一長為700nt的轉(zhuǎn)錄物RNAⅡ(preprimer)引發(fā)。RNAⅡ由宿主RNA聚合酶合成,經(jīng)構(gòu)象變化后,與模板DNA在復(fù)制起始區(qū)附近偶聯(lián)(coupling)形成RNAⅡ-DNA雜交物,RNaseH切割其中的RNA部分,產(chǎn)生游離的3‘-OH,再在DNA聚合酶Ⅰ的作用下,從這個游離的3’-OH開始DNA前導(dǎo)鏈的合成。3‘-OH的生成是復(fù)制起始的限速步驟,受反義RNA(RNAⅠ)調(diào)控。RNAⅠ序列與RNAⅡ的前108堿基序列完全互補,互補區(qū)結(jié)合可改變RNAⅡ下游效應(yīng)位點的二級結(jié)構(gòu),使RNAⅡ的3’端不能與模板DNA偶聯(lián),RNaseH就不能對RNAⅡ進(jìn)行加工,從而阻斷引物的生成,抑制復(fù)制的起始。12整理pptRegulationofplasmidcolE1copynumberbyantisenseRNA:

控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合RNAⅠ的啟動子是組成型的,故其數(shù)量與質(zhì)?？截悢?shù)成正比,但不穩(wěn)定。在ColE1中還有一個質(zhì)粒編碼的控制元件Rom蛋白(又稱Rop

蛋白),Rop蛋白是RNA結(jié)合蛋白,它能增強RNAⅠ與RNAⅡ的相互作用,穩(wěn)定RNAⅠ-RNAⅡ復(fù)合物,因而能加強對復(fù)制的抑制作用,但在上述控制回路中只起輔助作用。13整理ppt⑵抑制前導(dǎo)肽翻譯這種作用方式的例子是質(zhì)粒R1,它的基本復(fù)制子含有可讀框copB、tap和repA,分別編碼轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白CopB、前導(dǎo)肽TAP和起始必需蛋白RepA。tap和repA

是翻譯偶聯(lián)的。RepA蛋白是復(fù)制的限速因子,以順式作用,但不能重復(fù)使用,其復(fù)制控制在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平上進(jìn)行。主控制元件是RNAⅠ,名為CopA,從repA-mRNA前導(dǎo)區(qū)的一段互補鏈轉(zhuǎn)錄而來,長約90nt。14整理pptRegulationofplasmidR1copynumberbyantisenseRNA:

控制復(fù)制起始因子(RepA)與Ori結(jié)合,從而抑制其上游DnaA蛋白的結(jié)合,抑制復(fù)制起始轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控:

在repA基因上游有兩個啟動子,PO(組成型)和PA(調(diào)節(jié)型),分別轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA-CX和RNA-A,均可作為RepA的mRNA。此外在RNA-CX5’端還編碼CopB蛋白,可抑制PA開始的轉(zhuǎn)錄。翻譯水平調(diào)控:CopA可同RepA的mRNA5’端部分堿基序列互補結(jié)合,產(chǎn)生位阻效應(yīng)阻礙了前導(dǎo)肽基因(tap)的翻譯,進(jìn)而抑制了RepA

的合成(翻譯偶聯(lián)),影響質(zhì)粒復(fù)制15整理ppt四質(zhì)粒不相容性質(zhì)粒不相容性(plasmidincompatibility

)

指在沒有選擇壓力的情況下，同種的或親緣關(guān)系相近的兩種質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象，也稱為不親和性(inc)。例如colE1衍生質(zhì)粒，它們之間是互不相容的，也就是說，這些親緣關(guān)系較近的不同質(zhì)粒，當(dāng)兩種進(jìn)入同一細(xì)胞后，必定有一種在細(xì)胞的增殖過程中，被逐漸排斥(稀釋)掉。質(zhì)粒的不相容性是質(zhì)粒分類的重要標(biāo)志。

彼此不相容的質(zhì)粒屬于同一個不親和群(incompatiblitygroup)。而彼此能夠共存的親和質(zhì)粒，則屬于不同的不親和群。不親和群之間的質(zhì)粒是相容的，而同一個不親和群內(nèi)的質(zhì)粒是不相容的。16整理ppt質(zhì)粒不相容性的原因

質(zhì)粒的不相容性現(xiàn)象主要是與質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控和分離(segregation)機制有關(guān)，不能在同一細(xì)胞中并存的質(zhì)粒是因為他們共享一個或多個共同的復(fù)制因子或相同的分配系統(tǒng)。(對于單拷貝質(zhì)粒???)當(dāng)兩種復(fù)制及調(diào)控機制毫不相干的質(zhì)粒在同一個細(xì)胞中生存時,它們各自復(fù)制,再各自分配到不同的子細(xì)胞中,不會發(fā)生干擾。當(dāng)兩種復(fù)制及調(diào)控機制相關(guān)或相同的質(zhì)粒在同一個細(xì)胞中生存時,質(zhì)粒復(fù)制及調(diào)控機制就會把它們看做成同種質(zhì)粒而將他們的拷貝數(shù)控制在一定的數(shù)目內(nèi)。由于細(xì)胞時質(zhì)粒在子細(xì)胞中分配不均勻的緣故,經(jīng)過幾十次