第二章

微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第一節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)第二節(jié)顯微鏡和顯微技術(shù)第一節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)

微生物的培養(yǎng)物（culture)：一定條件下培養(yǎng)繁殖得到的微生物群體。

微生物的純培養(yǎng)物(purecultrue)：只有一種微生物的培養(yǎng)物?；蚨x為單個(gè)細(xì)胞或一種細(xì)胞群繁殖得到的后代。

微生物的純培養(yǎng)技術(shù)：從混雜存在的狀態(tài)分離、純化出特定的微生物的技術(shù)。培養(yǎng)物純培養(yǎng)物純培養(yǎng)技術(shù)如何操作？建立純培養(yǎng)，證實(shí)其純度無(wú)可置疑并保持不受污染是微生物學(xué)家最重要的任務(wù)之一！??！純培養(yǎng)得到的是只含一種微生物的培養(yǎng)體一無(wú)菌技術(shù)二用固體培養(yǎng)基獲得純培養(yǎng)三用液體培養(yǎng)基獲得純培養(yǎng)四單細(xì)胞（孢子）分離五選擇培養(yǎng)一無(wú)菌技術(shù)防止實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中不被其他微生物污染，自身也不污染操作環(huán)境的技術(shù)。實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程：分離、轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)純培養(yǎng)物等。1微生物培養(yǎng)的常用器具及其滅菌培養(yǎng)皿試管三角瓶塞子滅菌（讓容器內(nèi)不含任何生物）高壓蒸汽滅菌鍋電熱恒溫干燥箱紫外燈2無(wú)菌接種操作最常用的基本操作。

要點(diǎn)：在火焰附近熟練操作；在無(wú)菌操作箱操作；在無(wú)菌操作室（無(wú)菌間）操作。接種環(huán)接種針無(wú)菌吸管移液槍超凈工作臺(tái)二用固體培養(yǎng)基獲得純培養(yǎng)平板培養(yǎng)斜面培養(yǎng)獲得培養(yǎng)皿

菌落（colony）獲得試管

菌苔（lawn）1平板培養(yǎng)菌落概念——單個(gè)菌體在固體平面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖時(shí)形成的肉眼可見(jiàn)的群體。菌落※

菌落的分類

表面菌落：長(zhǎng)在表面。

埋藏菌落：在表面下生長(zhǎng)。（1）根據(jù)生長(zhǎng)部位分（2）根據(jù)形成菌落的菌有無(wú)莢膜分S型菌落Smooth:產(chǎn)莢膜菌形成的濕潤(rùn)光滑型菌落。R型菌落Rough:不產(chǎn)莢膜菌形成的干燥型菌落。菌落（R型）菌落（S型）※

菌落形態(tài)特征的描述（選孤立菌落）形態(tài)、大小邊緣、隆起光澤、質(zhì)地顏色等?！涞淖饔茫?）分離純培養(yǎng)（2）計(jì)數(shù)※

菌落的分類鑒定價(jià)值：

（1）不同菌的菌落不同。

（2）同種菌在不同培養(yǎng)基上菌落不同。

（3）同種菌在不同培養(yǎng)條件下菌落不同。2斜面培養(yǎng)菌苔概念：菌體在固體斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖形成的肉眼可見(jiàn)的群體。作為微生物分類鑒定的依據(jù)3用固體培養(yǎng)基獲得純培養(yǎng)的方法（1）涂布平板法（spreadplatemethod)（2）稀釋倒平板法（pourplatemethod）（3）平板劃線法（streakplatemethod）（4）稀釋搖管法（shaketubemethod）涂布平板法：

方法：先制無(wú)菌平板，再涂布菌懸液。特點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，但易造成機(jī)械損傷。菌落：表面菌落。

稀釋倒平板法（稀釋傾注法）

特點(diǎn)：可定性、定量。

方法：先取菌稀釋液注入平皿，再注入45℃左右的培養(yǎng)基，混合均勻。

菌落：表面菌落和埋藏菌落

平板劃線法

特點(diǎn)：快速、方便。方法：分段劃線（適用于濃度較大的樣品）連續(xù)劃線（適用于濃度較小的樣品）菌落：表面菌落

稀釋搖管法（自學(xué)）培養(yǎng)嚴(yán)格厭氧微生物使用。是稀釋倒平板法的一種變通形式。三用液體培養(yǎng)基獲得純培養(yǎng)適用于大細(xì)菌、原生動(dòng)物、藻類。將待測(cè)樣品做系列稀釋，使一支試管分配不到一個(gè)微生物。有微生物生長(zhǎng)的試管得到的培養(yǎng)物可能就是純培養(yǎng)物。有可能獲得純培養(yǎng)的那個(gè)稀釋度的大多數(shù)試管（＞95%）應(yīng)表現(xiàn)為沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)。

1菌膜

菌體在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)繁殖時(shí)，在液體表面形成的一層薄膜2菌環(huán)

菌體在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)繁殖沿試管壁液體表層形成的環(huán)狀3沉淀、混濁※

微生物在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)液體培養(yǎng)基中沉淀生長(zhǎng)混濁生長(zhǎng)表面生長(zhǎng)在顯微鏡下用顯微操縱器（單細(xì)胞挑取器）進(jìn)行。四單細(xì)胞（孢子）分離五選擇培養(yǎng)選擇平板培養(yǎng)：

加牛奶或酪素，篩選蛋白酶產(chǎn)生菌。加抗菌素篩選抗性菌株。見(jiàn)書P18。富集培養(yǎng)：

制定特定的培養(yǎng)環(huán)境條件，僅適合分離微生物的生長(zhǎng)，使其大量繁殖。從土壤分離能降解對(duì)羥基苯甲酸的微生物。見(jiàn)書P18。富集培養(yǎng)是微生物學(xué)研究重要的技術(shù)手段！可分離培養(yǎng)出由科學(xué)家設(shè)計(jì)的能在特定環(huán)境中生長(zhǎng)的微生物！第二節(jié)顯微鏡和顯微技術(shù)顯微觀察效果顯微鏡自身特點(diǎn)操作者技能放大倍數(shù)分辨率反差顯微鏡使用標(biāo)本制作觀察技術(shù)一顯微鏡的種類及原理二顯微觀察樣品的制備一顯微鏡的種類及原理普通光學(xué)顯微鏡暗視野顯微鏡（視野暗，樣品亮。細(xì)菌運(yùn)動(dòng)）相差顯微鏡（不染色觀察細(xì)微結(jié)構(gòu)）熒光顯微鏡（黑暗時(shí)熒光素吸收紫外線放出可見(jiàn)光）電子顯微鏡機(jī)械裝置——鏡座、支架、載物臺(tái)、調(diào)焦螺旋普通光學(xué)顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)——物鏡、目鏡、聚光器普通光學(xué)顯微鏡目鏡鏡體物鏡轉(zhuǎn)換器物鏡載物臺(tái)粗調(diào)節(jié)旋扭細(xì)調(diào)節(jié)旋扭臂物鏡：

低倍鏡高倍鏡40X油鏡100X聚光器光源分辨率——辨別兩點(diǎn)之間最小距離的能力。最小可分辨距離=0.5ληsinθη.sinθ又叫數(shù)值孔徑NA。顯微鏡的數(shù)值孔徑與鏡口角及工作距離間的關(guān)系η.sinθ——數(shù)值孔徑NA。以空氣做介質(zhì)同以香柏油做介質(zhì)的比較η.sinθ——數(shù)值孔徑NA。低倍鏡高倍鏡油鏡(a)×500(b)×175(c)×210(d)×600(e)×100(a)(b)暗視野顯微鏡觀察(c)(d)(e)相差顯微鏡觀察熒光顯微鏡觀察(a)×600相差顯微鏡(b)×100,000電子顯微鏡(c)×282,000電子顯微鏡(a)、(b)：一種紅螺菌(c)：人流感病毒細(xì)菌的掃描電鏡圖片×32,000二顯微觀察樣品的制備光學(xué)顯微鏡的制樣電子顯微鏡的制樣掃描電鏡的樣品制備光學(xué)顯微鏡的制樣活體觀察的制樣染色觀察的制樣活體觀察：

壓滴法懸滴法菌絲埋片法染色觀察細(xì)菌染色法死菌活菌：用美蘭或TTC（氧化三苯基四氮唑）染色正染色負(fù)染色：莢膜染色法等簡(jiǎn)單染色法鑒別染色