ICS07.100C53中華人民共和國國家標準GB15193.12—2003代替GB15193.12—1994體外哺乳類細胞（V79/HGPRT)基因突變試驗V79/HGPRTgenemutationtest2003-09-24發(fā)布2004-05-01實施中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布中國國家標準化管理委員會

GB15193.12—2003本標準全文強制本標準代替GB15193.12一1994《體外哺乳類細胞(V79/HGPRT)基因突變試驗》。本標準與GB15193.12—1994相比主要修改如下：-在“范圍”中增加了受試物的具體內容：食品生產、加工、保藏、運輸和銷售過程中所涉及的可能對健康造成危害的化學、生物和物理因素，檢驗對象包括食品添加劑(含營養(yǎng)強化劑）、食品新資源及其成分、新資源食品、輻照食品、食品容器與包裝材料、食品工具、設備、洗滌劑、消毒劑農藥殘留、獸藥殘留、食品工業(yè)用微生物等。自本標準實施之日起,GB15193.12—1994同時皮止。本標準由中華人民共和國衛(wèi)生部提出并歸口。本標準起草單位：中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與食品安全所。本標準主要起草人:馮繼農、高本標準于1994年首次發(fā)布，本次為第一次修訂。

GB15193.12—2003體外哺乳類細胞(V79/HGPRT)基因突變試驗1范圍本標準規(guī)定了體外哺乳類細胞(V79/HGPRT)基因突變試驗的基本技術要求.本標準適用于評價食品生產、加工、保藏、運輸和銷售過程中所涉及的可能對健康造成危害的化學、生物和物理因素的遺傳毒性，檢驗對象包括食品添加劑(含營養(yǎng)強化劑）食品新資源及其成分、新資源食品、輻照食品、食品容器與包裝材料、食品工具、設備、洗滌劑、消毒劑、農藥殘留、獸藥殘留、食品工業(yè)用微生物等。2原理細胞在正常培養(yǎng)條件下,對6-TG的毒性作用敏感，不能生存，在致癌物和/或致突變物作用下，某些細胞X染色體上控制次黃票嶺烏嘿吟磷酸核糖轉移酶(HGPRT)的結構基因發(fā)生突變,不能再產生HGPRT,從而使突變細胞對6-TG具有抗性作用。這些突變細胞在含有6-TG的選擇性培養(yǎng)液中能繼續(xù)分裂并形成集落。根據突變集落形成數,計算突變率以判定受試物的致突變性。3材料和試劑3.1細胞:使用中國倉鼠肺（V79)細胞株。為了減少自發(fā)突變率,正式實驗前先將野生型細胞群體中存在的自發(fā)HGPRT座位突變體選擇性殺滅,方法是將野生型細胞接種于含次黃票嶺及胸腺喀啶、氨甲蝶嶺、甘氨酸的MEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)1周.然后重新接種于MEM培養(yǎng)液中。3.2培養(yǎng)液:采用MEM(Eagle)基礎培養(yǎng)液或DMEM培養(yǎng)液,補以10%小牛血清及適量抗菌素(青霉素、鏈晾索）3.3磷酸鹽緩沖液(無鈣、鎂PBS)磷酸二氫鉀(KH.PO,）200mg磷酸氫二鈉(Na.HPO，·12H.O)2.898氮化鉀(KCI)200mg氯化鈉(NaCI)8.0g雙蒸水1000mL高壓消毒,121℃,0.103MPa,20min3.4胰蛋白酶/EDTA溶液;用無鈣、鎂PBS配制,胰酶的濃度為0.05%,EDTA的濃度為0,02%,胰蛋白酶與EDTA溶液按1：1混合。一20℃儲存，3.5受試物:最好能溶于培養(yǎng)液。也可溶于二甲基亞諷(DMSO),其濃度應低于0.5%（體積分數)。3.6陽性對照物：可根據受試物的性質和結構選用不同的陽性對照物,例如乙基磺酸酯(EMS),絲裂霉素C(MMC),甲基硝基亞硝基服(MNNG),苯并(a)花(BP)等3.76-TG:用0.5%碳酸氫鈉溶液配成1.0mg/ml.4C儲存。3.8大鼠肝勾漿S-9混合液：按Ames試驗程序制備操作步驃4.1細胞準備：將5×10°個細胞接種于