Chapter20蛋白質(zhì)的生物合成

編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因通過轉(zhuǎn)錄，將DNA上（基因上）的遺傳信息傳遞給mRNA。mRNA上的核苷酸順序直接決定蛋白質(zhì)多肽鏈的氨基酸的順序。本章講授的主要內(nèi)容:mRNA的核苷酸順序是如何編碼氨基酸順序的呢？

蛋白質(zhì)生物合成的機制是怎樣的呢？一、遺傳信息是如何編碼氨基酸的？

遺傳學(xué)實驗證明，三個核苷酸代表一種氨基酸是一種正確的比例，因此每三個核苷酸即為一個氨基酸的一個遺傳密碼。采用突變試驗可以證明:（同時增加三個或減少三個，可得到類似的結(jié)果）二、密碼子是如何闡明的？1、用無細胞測活系統(tǒng)檢驗人工合成的或酶促合成的多核苷酸的表達情況●無細胞測活系統(tǒng)：●用單一核苷酸的聚合體，例如poly(U)、poly(A)等作為模板，檢測氨基酸的入情況，證實UUU是Phe的密碼子，AAA是Lys的密碼子。（介紹檢測實驗如何操作）●多核苷酸磷酸化酶（polynucleotidephosphorylase）在密碼子揭示中的作用2、用核糖體結(jié)合技術(shù)證實了各種密碼子的組成和核苷酸的順序1964年，Nirenberg發(fā)現(xiàn)：◆人工合成的三核苷酸可以起到mRNA模板的作用；◆在無GTP存在下，三核苷酸可以指導(dǎo)相應(yīng)的氨酰-tRNA（即結(jié)合有某種氨基酸的tRNA）結(jié)合到核糖體上；◆硝酸纖維素膜能結(jié)合氨酰-tRNA而不結(jié)合游離的tRNA。

◆由于三核苷酸模板只與一定的tRNA進行密碼子與反密碼子識別，而tRNA又只能與一定

的氨基酸結(jié)合。因此，只要有帶放射性標記的氨基酸被膜保留，即可測知模板是什么氨基酸的密碼子(圖)。利用上述方法(包括人工合成的有規(guī)定順序的多核苷酸作模板)于1966年完整地闡明了編碼20種氨基酸61種密碼子，其他三種密碼子UAG,UAA和UGA是蛋白質(zhì)合成終止信號，即終止密碼子三、密碼子的性質(zhì)1、密碼子的簡并性（degeneracy）：

★一種氨基酸由幾種密碼子編碼的現(xiàn)象即稱為簡并?！锞幋a一種氨基酸的幾種密碼子稱為同義密碼子（synonyms）。★只有Met和Trp分別只有一種密碼子?！锩艽a子的簡并多數(shù)是第三位核苷酸有區(qū)別。例如His的密碼子：CAU、CAC；Gln的密碼子：CAA、CAG。

如果已知某多肽的氨基酸序列，根據(jù)氨基酸密碼子的簡并性，可推導(dǎo)該肽多種mRNA的序列（圖）2、密碼子幾乎是通用的

密碼子對胞液蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)來說是通用的，但在線粒體蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中有些例外:

Codon(5'→3')胞液編碼線粒體編碼

AUAIle

MetAUGMetMetUGATerm

TrpUGGTrpTrpAGAArg

TermAGGArg

Term.3、密碼子是不重疊的

密碼子的不重疊和基因的重疊是不相同的（圖）?；虻闹丿B是由于識讀起點不同即閱讀框不同所造成的（圖）4、方向性5、起始信號是兼職的

在原核生物中，AUG和GUG具有雙重功能，在作為蛋白質(zhì)合成的起始密碼子時，它們都編碼甲酰-Met；如果出現(xiàn)在信使內(nèi)部時，它們則分別編碼Met和Val。在真核生物中，只有AUG兼有兩者的功能，都編碼Met。6、密碼子無標點符號

Section2．蛋白質(zhì)生物合成中的大分子一、mRNAmRNA是蛋白質(zhì)合成的直接模板，蛋白質(zhì)的氨基酸順序由mRNA上三聯(lián)體密碼子的順序決定。

在原核生物生物mRNA5’-端起始密碼子前的前導(dǎo)順序有一段富含嘌呤核苷酸順序，能同16SrRNA3’-端的一段富含嘧啶的堿基順序互補,這一特性可以將30S核糖體小亞基結(jié)合在鄰近mRNA起始密碼子的特定部位上。與蛋白質(zhì)合成或起始合成有關(guān)。真核生物mRNA5'-端甲基化的“帽”結(jié)構(gòu)可能也與蛋白質(zhì)合成起始有關(guān)。二、tRNAtRNA是氨基酸的載體，以氨酰-tRNA的形式為蛋白質(zhì)的合成提供氨基酸。它通過反密碼子與密碼子的相互作用，識別mRNA的信息，將其翻譯成氨基酸。1、同功受體

能接受同一種氨基酸的多種tRNA叫做同功受體（isoacceptor）或同功轉(zhuǎn)移RNA。例如：Val有三種tRNA可以與它結(jié)合。這可能與Val有四種密碼子有關(guān)，因為其中三種可與三種相應(yīng)的tRNA結(jié)合：RNA反密碼子

密碼子

氨基酸5'IGC3'5'GUU3'ValGACGUCValUACGUAValGUGVal2、tRAN反密碼子的擺動性

擺動性是指一種氨基酸的tRNA上的反密碼子可以同該氨基酸的幾種密碼子配對結(jié)合。例如：酵母丙氨酸的4種密碼子

5'－GCU－3',

－GCC－－GCA－可以和酵母丙氨酸t(yī)RNA(tRNAAla)反密碼子5’-IGC-3’配對。酵母tRNAArg的反密碼子5’-ICG-3’能識別精氨酸3種密碼子：5’-CGA-3’，5’-CGU-3’，5’-CGC-3’。

密碼子與反密碼子之間的配對關(guān)系反密碼子的擺動性擺動學(xué)說認為，除了標準堿基配對外，還有非標準配對。擺動性一般出現(xiàn)在tRNA反密碼子的第一位堿基和密碼子的第三位堿基之間。擺動學(xué)說的堿基配對規(guī)律是(圖)：

反密碼子的

密碼子的

第一位堿基

第三位堿基

AUCGGC或UUA或GIU或C或A三、氨酰-tRNA合成酶（氨基酸：tRNA連接酶）1、為什么氨基酸不能直接參入到蛋白質(zhì)多肽鏈中？

★兩個氨基酸借肽鍵結(jié)合是需要能量的，而自由的氨基酸本身是不活潑的。氨基酸本身對它專一的密碼子是不能識別的。2、氨酰-tRNA合成酶催化氨酰-tRNA的合成氨酰-tRNA是氨基酸的激活形式，一種氨基酸只能與它的專一的tRNA結(jié)合。氨基酸與它的專一tRNA結(jié)合是由專一的氨酰-tRNA合成酶催化的，因此，細胞內(nèi)至少存在20種不同的氨酰-tRNA合成酶（鏈接），在ATP供能的情況下氨酰-tRNA合成酶催化氨酰-tRNA的合成。

每種氨酰-tRNA合成酶都專一于一種氨基酸和其相應(yīng)的一種或幾種tRNA。E.coli所有氨酰-tRNA合成酶的結(jié)構(gòu)都已測定，根據(jù)這些酶在一級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)上的不同(鏈接)以及反應(yīng)機制的差別（鏈接1）將其分為兩類（鏈接2）。這兩類酶在所有生物中都是相同的。a.E.coliglutamyl-tRNAsynthetase,aclassIenzyme;b.嗜熱菌glyciyl-tRNAsynthetase,aclassIIenzyme.一級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)上的不同C-2位連結(jié)C-3位連結(jié)反應(yīng)機制的差別根據(jù)反應(yīng)機制的差別將其分為兩類,這兩類酶在所有生物中都是相同的。一分子氨酰-tRNA的合成消耗兩個高能磷酸鍵。氨酰-tRNA合成酶催化的反應(yīng)分兩步進行：氨基酸的活化(氨酰腺苷酸的形成)：氨基酸＋ATP＋E→氨基酸·AMP·E＋PPi

（當(dāng)羧基被活化時往往形成?；佘账幔┌滨?tRNA的生成：氨基酸·AMP·E＋tRNA→氨酰-tRNA＋AMP＋E焦磷酸的水解可以推動合成氨酰-tRNA（使反應(yīng)變得不可逆）：

PPi＋H2O→2Pi△G0’=～﹣29.3kJ.mol-13、氨酰-tRNA合成酶具有校對功能例如：Val和Ile很相似，于是存在這樣一種可能性，即把Val結(jié)合到tRNAIle上，并參入到Ile在肽鏈中的部位上。由于Ile-tRNA合成酶能進行校對，能阻止Val的滲入。因為Ile-tRNA合成酶能催化下面的反應(yīng)：EIle·(Val·AMP)＋H2O→Val＋AMP＋EIle4、氨酰-tRNA合成酶和tRNA的相互作用起著“第二套遺傳密碼子”的作用一種氨酰-tRNA合成酶必須對一種氨基酸和它的tRNA是高度專一的。這就要求一給定氨酰-tRNA合成酶既能識別給定的氨基酸，又能識別該氨基酸相應(yīng)的tRNA。這種相互識別是非常重要的，因為這對于保證密碼子的正確翻譯和蛋白質(zhì)合成的準確性是絕對必要的。在tRNA分子中，某些核苷酸是保守的，因而它們不可能被氨酰-tRNA合成酶用來甄別不同的tRNA。通過對能改變底物專一性的核苷酸變化研究，發(fā)現(xiàn)能被氨酰-tRNA合成酶用來甄別tRNA的核苷酸集中在氨基酸臂和反密碼(包括反密碼子本身)，有些位于tRNA的其他部位(圖b)。圖c是天冬氨酰-tRNA合成酶與被它識別的tRNA以及ATP所形成的復(fù)合物的X-射線晶體衍射圖，該圖顯示氨基酸臂和反密碼臂是相互識別的部位。這些研究結(jié)果顯示氨酰-tRNA合成酶和tRNA的相互作用起著“第二套遺傳密碼子”的作用。藍色的點表示在所有tRNA中位置都是相同的核苷酸；桔紅色或綠色是表示能被一種（桔紅色）或多種（綠色）氨酰-tRNA合成酶識別的位點。結(jié)構(gòu)特征而不是順序?qū)δ承┌滨?tRNA合成酶的識別來說是重要的。該圖顯示氨基酸臂和反密碼臂是相互識別的部位氨酰-tRNA合成酶和tRNA的相互作用起著“第二套遺傳密碼子”的作用四、核糖體核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所。核糖體是由rRNA和多種蛋白質(zhì)組裝成的一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子結(jié)合體。在核糖體的大亞基上有二個不同的部位：氨酰-tRNA接受部位(A部位)；肽基-tRNA結(jié)合部位（P部位）。核糖體的結(jié)構(gòu)→多核糖體：在一條mRNA鏈上結(jié)合多個核糖體。每個核糖體都能單獨執(zhí)行合成一條同樣的多肽鏈Section3原核生物蛋白質(zhì)生物合成一、蛋白質(zhì)合成的起始1、甲酰甲硫氨酰-tRNA的合成

E.coli和其他細菌合成蛋白質(zhì)的起始氨基酸是甲酰甲硫氨酸（fMet）。在E.coli細胞內(nèi)存在兩種可與Met結(jié)合的tRNA即tRNAfMet和tRNAmMet。兩種tRNA各司其職。但兩者的反密碼子是相同的（CAU）。

★當(dāng)Met與tRNAfMet結(jié)合后(即Met-tRNAfMet）可被甲?；▓D）生成fMet-tRNAfMet，可以作為蛋白質(zhì)合成的起始物：

Met＋tRNAfMet＋ATP→Met-tRNAfMet＋ADP＋Pi

Met-tRNAfMet＋N10-甲酰四氫葉酸→fMet-tRNAfMet＋FH4★當(dāng)Met與tRNAmMet結(jié)合后生成Met-tRNAmMet，不能被甲酰化，只能用于肽鏈的延長反應(yīng)。甲?；D(zhuǎn)移酶只能識別Met-tRNAfMet，而不能識別Met-tRNAmMet。

●什么因素能保證fMet-tRNAfMet只能識別起始密碼子AUG,而不能識別信使內(nèi)的AUG（Met的密碼子）呢？2、起始復(fù)合物的形成1)30S起始復(fù)合物的形成在E.coli中，業(yè)已證明起始因子參與了30S起始復(fù)合物的形成。這些因子是IF-1、IF-2和IF-3。

2)70S起始復(fù)合物的形成30S起始復(fù)合物的形成創(chuàng)造了與50S核糖體大亞基結(jié)合的條件，可以同50S亞基結(jié)合形成70S起始復(fù)合物。當(dāng)50S同30S起始復(fù)合物結(jié)合時，伴隨著GTP的水解，同時釋放出IF-3、IF-1和IF-2。這樣fMet-tRNAfMet就占據(jù)著核糖體的P部位。在70S起始復(fù)合物形成時，IF-2起著水解GTP的作用，并使30S起始復(fù)合物的構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致了IF-3、IF-1和IF-2的釋放。二．肽鏈的延伸（Elongation）70S起始復(fù)合物形成之后，便可發(fā)生肽鏈延伸（Elongation）的循環(huán)反應(yīng)（圖）。該循環(huán)反應(yīng)包括三個步驟：■氨?；?tRNA進入到核糖體的A部位；■肽鍵的形成；■移位反應(yīng)（translocation）。

延長反應(yīng)需要三種蛋白質(zhì)因子參與。這些延長因子（Elongationfactors）是：EF-Tu、EF-Ts和EF-G。三、肽鏈合成的終止遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究表明，在mRNA上存在三種終止密碼子：UAG、UAA、UGA。終止密碼子的識別需要特殊的終止因子或釋放因子。在原核生物中，分離到三種與肽鏈合成終止有關(guān)的釋放因子(Releasingfactors)：RF-1、RF-2、RF-3。RF-1能識別終止密碼子UAA和UAG；RF-2能識別終止密碼子UAA和UGA；

RF-3是一種GTP結(jié)合蛋白，本身對終止密碼子沒有識別能力，但它在與GTP結(jié)合后能促進RF-1和RF-2同核糖體結(jié)合的能力。當(dāng)終止密碼子出現(xiàn)在核糖體A部位相對應(yīng)的地方時，完整的多肽已經(jīng)移位到P部位。此時終止過程便開始了(圖)。在GTP的存在下，釋放因子識別終止密碼子，并結(jié)合到A部位，誘導(dǎo)肽基轉(zhuǎn)移酶的活性改變，使其具有水解酶活性(或者說這個酶能催化肽基轉(zhuǎn)移到水分子上而發(fā)生水解反應(yīng))。這樣即可水解肽鏈和tRNA之間的酯鍵，從而釋放出完整的肽鏈。然后，釋放因子在GTP水解的情況下從核糖體上釋放出來(RF具有依賴于核糖體的GTPase的活性)，tRNA和mRNA從核糖體上也釋放出來。核糖體的大小兩個亞基隨之解離，并可重新裝配成70S起始復(fù)合物。mRNA很不穩(wěn)定，很快就會被降解。四、新合成的多肽鏈經(jīng)受折疊和加工新生的多肽鏈需要折疊和加工才能成為生物學(xué)上活潑的分子。在合成時或合成后，多肽通過側(cè)鏈疏水相互作用以及合適的氫鍵、離子鍵、范德華力的形成、折疊成它的天然構(gòu)象，mRNA一維的遺傳信息轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)合成后的加工或修飾(posttranslationalmodifications)包括：①氨基末端和羧基末端的修飾；②信號順序的切除；③個別氨基酸的修飾；④糖基化；⑤輔基的加入；⑥肽鏈的局部水解；⑦二硫鍵的形成等。四、蛋白質(zhì)合成過程中的能量問題蛋白質(zhì)生物合成是一個耗能過程，需要消耗ATP和GTP?！預(yù)TP主要用于氨基酸的活化(生成氨酰-tRNA)?！頖TP的主要作用不是為生物合成提供能量。

●從蛋白質(zhì)合成的全過程看，第一個肽鍵的形成至少需要消耗7個高能鍵：▲fMet-tRNAfMet的形成，消耗1分子ATP，即兩個高能鍵；▲第二個氨酰-tRNA的形成；消耗1分子ATP，即兩個高能鍵；

▲70S起始復(fù)合物的形成，消耗1分子的GTP；▲氨酰-tRNA進入A部位，EF-Tu的釋放，消耗1分子的GTP；▲移位反應(yīng)消耗1分子的GTP●以后的肽鏈延長反應(yīng)，每參入一個氨基酸，消耗4個高能鍵。最后肽鏈合成的終止反應(yīng)消耗1分子GTP。例如：合成由200氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)，總共要消耗(7+198×4+1）=800的高能鍵。因此，蛋白質(zhì)的合成是一個高度耗能的過程。五、GTP在蛋白質(zhì)合成中的作用實驗表明，GTP的水解與蛋白質(zhì)合成中所涉及的蛋白質(zhì)因子的構(gòu)象改變有關(guān)，使這些因子循環(huán)結(jié)合到核糖體上和從核糖體上解離下來。當(dāng)以GTP的類似物鳥苷酰亞胺二磷酸(GDPNP)(圖)代替GTP同EF-Tu結(jié)合，EF-Tu·GDPNP復(fù)合物攜帶氨酰-tRNA進入到核糖體上后，EF-Tu·GDPNP不能從核糖體上解離下來，因為EF-Tu·GDPNP不能被水解。GTP水解的目的是為了改變EF-Tu的構(gòu)象，以便它從核糖體解離下來。而且還有實驗表明，當(dāng)GTP同EF-Tu結(jié)合后能增高EF-Tu同氨酰-tRNA以及同核糖體的親和力。當(dāng)GDP同EF-Tu結(jié)合時，它既不能與核糖體結(jié)合，也不能與氨酰-tRNA結(jié)合。

★23SrRNA幾乎可以肯定參與肽鍵形成的反應(yīng)，這是因為：●有證據(jù)表明RNA能作為催化劑；●RNA是核糖體的主要組分；●核糖體RNA在進化過程中比核糖體蛋白更具高度的保守性；●任何一種核糖體蛋白的缺失并不導(dǎo)致核糖體功能的消失；●能抑制蛋白質(zhì)合成的抗菌素的抗性突變株是由編碼rRNA的基因而不是編碼核糖體蛋白的基因的突變所致?！馠arryNoller的實驗表明，來自適溫細菌的50S亞基，除去它的95%的蛋白質(zhì)后，但保留它的完整的RNA，它的活性仍保留80%以上。★無義抑制因子阻止翻譯提前終止：能將某種氨基酸的密碼子（“有義”密碼子）轉(zhuǎn)變成終止密碼子的突變叫做無義突變(nonsensemutation)。這種突變會導(dǎo)致翻譯提前終止(prematureterminationoftranslation)。具有這種突變的生物可以通過某種tRNA基因的突變而得到“挽救”，這種突變的tRNA能識別無義密碼子(nonsensecodon)，因此稱之為無義抑制因子tRNA。這種無義抑制因子tRNA象它的野生型祖先一樣攜帶同一種氨基酸，并在終止密碼上把該氨基酸添加到正在生長著的肽鏈上，從而阻止肽鏈合成的終止。

例如：E.coli琥珀抑制因子(ambersuppressor，叫SU3)是一種tRNATyr，它的反密碼子已從野生型的GUA（它們識讀Tyr的密碼子UAU和UAC）突變成CUA（它可以識別琥珀終止密碼子UAG）。一種叫做SU3＋的E.coli細胞，在一種編碼必需蛋白質(zhì)的基因上具有致死的琥珀突變，如果Tyr代替原有野生型（正常的）氨基酸參入到該蛋白質(zhì)中而又不致使其失去活性的話，那么這個突變株是可以成活的。為什么細胞能耐受這樣的突變呢？因為突變的tRNA通常是同工受體的次要成員，而且能與釋放因子競爭終止密碼子。因此抑制因子挽救的突變體比正常的野生型細胞生長緩慢。

六、真核生物蛋白質(zhì)合成的有關(guān)問題真核生物蛋白質(zhì)的合成雖然比原核生物蛋白質(zhì)合成要復(fù)雜得多，但基本過程是相同的。兩類生物的蛋白質(zhì)合成的主要差別表現(xiàn)在合成的起始階段?！粽婧松锏鞍踪|(zhì)合成的起始氨基酸是Met而不是fMet；起始tRNA是tRNAiMet而不是tRNAfMet；起始密碼子只有AUG?！粼谡婧松镏校阎婕熬欧N蛋白質(zhì)因子參與蛋白質(zhì)合成的起始(表)。真核生物蛋白質(zhì)合成起始因子用eIF表示。eIF-2由三個亞基組成：α亞基參與GTP的結(jié)合；β亞基與Met-tRNAiMet結(jié)合有關(guān)；γ-亞基的功能尚不清楚。

①首先，eIF-2在GTP的存在下，將Met-tR