流式細胞術(shù)原理和應(yīng)用■姓名：白小燕■專業(yè)：微生物學(xué)一

簡介二構(gòu)造及工作原理三FCM的數(shù)據(jù)分析FCM的應(yīng)用一簡介

流式細胞儀(FlowCytometer):是集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機技術(shù)、細胞熒光化學(xué)技術(shù)以及單克隆抗體技術(shù)為一體的高科技細胞分析儀。流式細胞術(shù)(FlowCytometry，F(xiàn)CM):利用流式細胞儀對處于快速直線流動狀態(tài)中的細胞或亞細胞結(jié)構(gòu)進行多參數(shù)、快速的定量分析和分選的技術(shù)。流式細胞儀的特點單個細胞或微粒分析同時多參數(shù)分析速度快：10000個細胞(微粒)/秒統(tǒng)計學(xué)意義：提供細胞群體的均值和分布情況分選感興趣的細胞或微粒流路(液流系統(tǒng)）流動室 鞘液SHEATH樣本流SAMPLE單細胞懸液5*105~1*106個/ml光路（光學(xué)系統(tǒng)）光源濾片電路（檢測系統(tǒng)）光電倍增管PMT放大電路HV及GAIN增益A/D轉(zhuǎn)換統(tǒng)計（分析系統(tǒng)）計算機二構(gòu)造及工作原理

流動室是儀器核心部件，被測樣品在此與激光相交。流動室由石英玻璃鋼制成，并在石英玻璃中央開一個孔徑為430μm×180μm的長方形孔，供細胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心，這種流動室的光學(xué)特性良好，流速較慢，因而細胞受照時間長，可收集的細胞信號光通量大，配上廣角收集透鏡，可獲得很高的檢測靈敏度和測量精度。液流系統(tǒng)流動室InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid液流系統(tǒng)激光光源：目前臺式機FCM，大多采用氬離子氣體激光器。激光(laser)是—種相干光源，它能提供單波長、高強度及穩(wěn)定性高的光照，是細胞微弱熒光快速分析的理想光源。由于細胞快速流動，每個細胞經(jīng)過光照區(qū)的時間僅為1μs左右，每個細胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號強弱，與被照射的時間和激發(fā)光的強度有關(guān)，因此細胞需要足夠的光照強度。

光學(xué)系統(tǒng)信號散射光信號

FS細胞大小

SS細胞顆粒性熒光信號

FL1–FITC

FL2–PE

FL3–ECD

FL4–PC5光學(xué)系統(tǒng)散射光信號——

細胞大小及顆粒性FSSS光學(xué)系統(tǒng)光路（濾片特性）光學(xué)系統(tǒng)電路電壓調(diào)節(jié)光電倍增管電壓volts增益Gain信號放大方式檢測系統(tǒng)電信號輸入到放大器放大，放大器分兩類：線性放大和對數(shù)放大。細胞DNA含量、RNA含量等的測量一般選用線性放大測量。在細胞膜表面抗原等的檢測時，細胞膜表面抗原的分布有時要相差幾十倍，甚至幾萬倍，通常使用對數(shù)放大器。

檢測系統(tǒng)常用熒光染料介紹FITC：綠色525nmPE：橙黃色575nmECD：橙紅色610nmPE－CY5：深紅色675nmPerCP：深紅色675nmPE－CY7：深紅色755nm7AAD：深紅色675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色620nm 488nm波長的氬離子激光激發(fā)三FCM的數(shù)據(jù)分析單參數(shù)一維直方圖縱坐標表示細胞數(shù)，橫坐標表示相對熒光信號或散色光信號值，單位是道數(shù)。2.雙參數(shù)二維點圖顯示來自同一細胞的兩個參數(shù)與細胞數(shù)量間的關(guān)系。橫、縱坐標分別表示兩個參數(shù)的相對含量。通過分別計算兩坐標所表示參數(shù)的陽性率來得到實驗結(jié)果。白血病免疫分型HLA-B27:強直性脊柱炎淋巴細胞亞群造血干細胞計數(shù)：造血干細胞移植網(wǎng)織紅細胞PNH診斷（CD55、CD59）血小板活化試驗1流式細胞術(shù)的臨床應(yīng)用四FCM的應(yīng)用細胞大小細胞的顆粒度細胞表面分子：CD系列細胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細胞因子細胞核內(nèi)分子：P53細胞功能檢測：細胞周期、凋亡2流式細胞術(shù)的科研應(yīng)用概念：白細胞分化抗原(DC)CD(clusterofdifferentiation)指的是分化群或分化簇。在使用CD命名細胞膜表面免疫標志的初期，他專職白細胞膜上的抗原或抗原識別的抗體，故又稱白細胞分化抗原。目前“CD”代表的不僅僅是白細胞表面抗原，還有紅細胞膜表面抗原、血小板表面抗原、髓系細胞表面抗原及其他組織細胞表面或細胞內(nèi)的抗原等，研究方法以流式細胞術(shù)檢測法為主。1、在血液學(xué)中的應(yīng)用：2、細胞周期分析：DNA的含量隨細胞周期(G1，S，G2，M)的各個時期呈現(xiàn)出周期性的變化G1期，是細胞RNA和蛋白質(zhì)的合成期，即DNA合成前期,此時細胞核內(nèi)DNA含量保持二倍體；進入S期后，DNA開始合成，即DNA合成期,細胞核內(nèi)DNA的含量介于二倍體至四倍體之間；細胞進入G2期，即細胞分裂前期，DNA含量為四倍體,直到進入M期，即細胞分裂期,細胞分成兩個子細胞,M期結(jié)束進入下一個細胞周期。1）細胞增殖周期各時相細胞數(shù)的比率:

在生物細胞核中，DNA含量隨細胞增殖周期時相不同而發(fā)生變化。因此，不同種類的細胞，其細胞各期（G0/1期,S期,G2/M期）百分比含量是不同的。亞G1峰檢測：凋亡細胞最突出的形態(tài)學(xué)特征是細胞核固縮、染色質(zhì)濃集、細胞體變圓皺縮而細胞膜保持完整，其中胞核變化尤為突出。染色質(zhì)濃集是由于凋亡細胞雙鏈DNA發(fā)生裂解所致。DNA降解后，形成長度為180-200bp的DNA片段，稱凋亡小體。即在流式細胞檢測上可出現(xiàn)亞二倍體(G1)峰值。而常規(guī)壞死的DNA分解是隨機的，DNA片段大小不一，在流式細胞檢測上可出現(xiàn)比亞二倍體(G1)峰更