實(shí)驗四

微生物菌落的觀察和細(xì)菌的運(yùn)動性觀察目的要求學(xué)會觀察、識別各種不同的微生物菌落的方法。掌握平板菌落計數(shù)的方法，運(yùn)用所學(xué)的知識詳細(xì)的描述所分離平板上的各種微生物菌落。了解普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造和原理，熟悉其使用的正確方法。

學(xué)習(xí)并掌握油鏡的使用方法，學(xué)會用壓滴法或懸滴法觀察細(xì)菌運(yùn)動性的基本技術(shù)。實(shí)驗原理對于一些難區(qū)別的菌落還應(yīng)該借助顯微鏡來觀察其細(xì)胞形態(tài)以進(jìn)一步做出正確的判斷。

1.物鏡轉(zhuǎn)換器2.接物鏡3.游標(biāo)卡尺

4.載物臺5.聚光器

6.彩虹光闌7.光源

8.鏡座9.電源開關(guān)

10.光源滑動變阻器

11.粗調(diào)螺旋12.微調(diào)螺旋

13.鏡臂14.鏡筒

15.目鏡16.標(biāo)本移動螺旋

顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率

1.放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)

2.

顯微鏡的分辨率

是表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點(diǎn)之間距離的能力。（一）普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造D：物鏡分辨出物體兩點(diǎn)間的最短距離；NA，數(shù)值孔徑，是物鏡的參數(shù)之一；

：入射光的波長（可見光平均0.55m)n:物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率；（空氣為1.0，水為1.33，玻璃為1.52，甘油為1.47，香柏油為1.515。）

：鏡口角（即入射角）：是指從物鏡光軸上的物點(diǎn)發(fā)出的光線與物鏡前透鏡有效直徑的邊緣所張的角度。比如，肉眼所能感受的光波平均長度為0.55μm，假如NA=0.65的接物鏡，它的分辨力D=?*0.55/0.65=0.42μm以下的兩點(diǎn)間的距離就分辨不出來了，即使使用倍數(shù)更大的接目鏡使其總放大率增加也仍分辨不出，只有改用數(shù)值孔徑更大的接物鏡才行。顯微鏡的分辨率可用公式表示為：D=λ/2NA

=λ/2nsin(α/2)（二）油鏡的使用原理油鏡，即油浸接物鏡。當(dāng)光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。加入中間的介質(zhì)是一層香柏油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進(jìn)光量，從而使物象更加清晰。實(shí)驗材料實(shí)驗三所作的平板培養(yǎng)物：A，在細(xì)菌培養(yǎng)基上生長的各種菌落；B，在霉菌培養(yǎng)基上生長的各種菌落。實(shí)驗二所作的試管斜面，酒精燈、接種環(huán)等。蓋玻片、凹玻片、接種環(huán)、酒精燈。菌種：大腸桿菌E.coli，枯草桿菌B.subtilis或?qū)嶒炄囵B(yǎng)菌種實(shí)驗程序Ⅰ（觀察描述菌落特征）運(yùn)用所掌握的各種微生物菌落的特點(diǎn)，觀察、識別、描述所做樣品的兩個平板上的所有菌落,并將結(jié)果填入表1中。常用的菌落描述詞語：大?。捍?、中、小、針尖狀形狀：圓形、隆起、扁平、假根狀、不規(guī)則狀等；邊緣情況：整齊、波形、裂葉狀、鋸齒狀等表面情況：干燥、濕潤、光滑、皺褶、顆粒狀、龜裂狀等；表1平板菌落特征描述定義:根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的單個菌落是由一個單細(xì)胞繁殖而成這一培養(yǎng)特征而設(shè)計的計數(shù)方法，即一個菌落代表一個單細(xì)胞。統(tǒng)計菌落數(shù)目，即可計算出樣品中的含菌數(shù)。此法所計算的菌數(shù)是培養(yǎng)基上長出來的菌落數(shù)，故又稱活菌計數(shù)。對土壤中的微生物進(jìn)行計數(shù),將結(jié)果填入表2中。實(shí)驗程序Ⅱ（平板菌落計數(shù)）表2土壤中微生物計數(shù)結(jié)果

計數(shù)方法:每克土壤的菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)

計算結(jié)果時，常按下列標(biāo)準(zhǔn)從接種后的2個或3個稀釋度中選擇一個合適的稀釋度，求出每克菌劑中的含菌數(shù)。

（1）同一稀釋度各個重復(fù)的菌數(shù)相差不太懸殊。

（2）細(xì)菌、放線菌、酵母菌以每皿30—300個菌落為宜，霉菌以每皿10—100個菌落為宜。

選擇好計數(shù)的稀釋度后，即可統(tǒng)計在平板上長出的菌落數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果按下式計算。實(shí)驗程序Ⅲ顯微鏡（油鏡）的使用：

1、用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔。

2、打開光源，調(diào)節(jié)光亮度

3、低倍鏡觀察：粗調(diào)、細(xì)調(diào)4、依次再進(jìn)行中倍、高倍觀察

5、油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標(biāo)本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細(xì)調(diào)至看清物象為止。

6、換片：另換新片，必須從第三條開始操作。

7、用后復(fù)原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復(fù)原。一、結(jié)合標(biāo)本片的觀察，掌握油鏡的使用方法；觀察各類微生物染色片，邊觀察邊繪圖。二、細(xì)菌運(yùn)動性的觀察（壓滴法）：(1)

制備菌液：從幼齡菌斜面上，挑數(shù)環(huán)菌放在裝有1～2mL無菌水的試管中，制成輕度混濁的菌懸液。(2)取2～3環(huán)稀釋菌液于潔凈載玻片中央，再加入一環(huán)0.01%的美藍(lán)水溶液，混勻。(3)用鑷子夾一潔凈的蓋玻片，先使其一邊接觸菌液，然后慢慢地放下蓋玻片，這樣可防止產(chǎn)生氣泡。(4)

鏡檢：將光線適當(dāng)調(diào)暗，先用低倍鏡找到觀察部位，再用高倍鏡觀察。要區(qū)分細(xì)菌鞭毛運(yùn)動和布朗運(yùn)動，后者只是在原處左右擺動，細(xì)菌細(xì)胞間有明顯位移者，才能判定為有運(yùn)動性。二、細(xì)菌運(yùn)動性的觀察（懸滴法）：1.制備菌液：在幼齡菌斜面上，滴加3-4mL無菌水，制成輕度混濁的菌懸液。2.涂凡士林：取潔凈無油的蓋玻片1塊，在其四周涂少量的凡士林（或香柏油）。3.滴加菌液：加1滴菌液于蓋玻片的中央，并用記號筆在菌液的邊緣做一記號，以便在顯微鏡觀察時，易于尋找菌液的位置。4.蓋凹玻片

將凹玻片的凹槽對準(zhǔn)蓋玻片中央的菌液，并輕輕地蓋在蓋玻片上，使兩者粘在一起，然后翻轉(zhuǎn)凹玻片，使菌液正好懸在凹槽的中央，再用鉛筆或火柴棒輕壓蓋玻片，使玻片四周邊緣閉合，以防菌液干燥。5.鏡檢

先用低倍鏡找到標(biāo)記，再稍微移動凹玻片即可找到菌滴的邊緣，然后將菌液移到視野中央換高倍鏡觀察。由于菌體是透明的，鏡檢時可適當(dāng)縮小光圈或降低聚光器以增大反差，便于觀察。鏡檢時要仔細(xì)辨別是細(xì)菌的運(yùn)動還是分子運(yùn)動（即布朗運(yùn)動）。實(shí)驗程序Ⅳ（無菌操作技術(shù)

）1.用接種環(huán)轉(zhuǎn)接菌種點(diǎn)燃酒精燈左手夾住兩試管：斜面向上，45～0度角。灼燒接種環(huán)右手拔棉塞，管口過火取菌，接種，標(biāo)記，培養(yǎng)2.平板劃線技術(shù)用接種環(huán)取菌懸液或菌苔。在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，劃線，方法如下（劃線的方法有很多（平行劃線、“