第十章：動物配子與胚胎生物工程

第一講：體外受精技術

一．概述二．卵母細胞的體外成熟三．卵子和精子的體外受精四．早期胚胎的體外培養(yǎng)五．影響體外受精的因素六．應用前景

一、概述

（一）定義從狹義上講，體外受精（invitrofertilization）是指將動物受精過程中的精卵結合在體外環(huán)境下完成的一種現(xiàn)象，包括自然條件下的體外受精（兩棲類和魚類的正常生殖過程）和人為培養(yǎng)條件下的體外受精（哺乳動物）。哺乳動物的體外受精實質將精子和卵子分別從公、母畜體內取出并經(jīng)過一系列的處理，使精卵在體外條件下結合的過程。體外受精的主要內容包括：1）卵母細胞的體外成熟(invitromaturation,IVM)2）卵子精子體外受精(invitrofertilization,IVF)；3）受精卵的體外培養(yǎng)(invitroculture,IVC)。體外受精程序

(二)體外受精的意義一、提高動物繁殖力的有效措施(精卵)二、體外受精可為胚胎移植提供充足而廉價的胚胎,為工廠化生產(chǎn)胚胎提供可能三、為其他動物繁殖生物技術，如動物克隆、動物轉基因工程和胚胎干細胞等研究提供豐富的試驗材料和必要的研究手段四、有利于揭示受精的本質和機理，并有助于研究胚胎的分化和發(fā)育。

（三）研究歷史體外受精是在20世紀80年代初研究成功,并在近10年得到逐步完善的一項配子與胚胎生物技術,1959年，張明覺利用獲能處理的家兔精子進行體外受精實驗，獲得了世界上第一批體外受精的試管小兔;1982年，美國學者Brackett等成功報道世界首例體內成熟的卵母細胞經(jīng)體外受精獲得試管牛；體外成熟卵母細胞和完全體外化的試管牛也分別于1986年和1988年報道成功。目前,一套高效的牛胚胎體外生產(chǎn)程序已經(jīng)建立起來,并逐步進入生產(chǎn)推廣的產(chǎn)業(yè)化階段。我國體外受精技術的研究起步于80年代后期，但進展很快，已先后在人和牛等8種動物取得成功。特別是人和牛的體外受精技術已達到國際先進水平，每年約有近千例試管嬰兒誕生。

二、卵母細胞的體外成熟

（一）卵母細胞的采集

1.離體卵巢采卵

母畜屠宰后，取出卵巢并方如盛有消毒的PBS或生理鹽水的保溫瓶（25~30℃）中，在4~6小時之內送到實驗室。從卵巢上回收卵母細胞主要有兩種方法：（1）卵泡抽吸法

用5~10ml的注射器連接一支16號針頭，將針頭插入卵泡而抽吸卵母細胞。此法的優(yōu)點是容易操作且速度較快，但回收率偏低（60~80%）且易損傷卵母細胞周圍的卵球細胞從而影響卵母細胞的質量（2）卵巢解剖法

首先用手術剪刀將卵巢上的卵泡單個的剪下，然后在盛有回收液的器皿中用經(jīng)消毒的刀片劃破卵泡，最后將器皿置于解剖顯微鏡下收集卵母細胞。此法的優(yōu)點是回收率高，可達90%以上。但操作復雜回收速度較慢而且容易造成污染。

2．活體采卵

卵母細胞的活體采集是通過體外受精技術生產(chǎn)良種胚胎的一種主要途徑。因從屠宰場收集到的卵巢種質一般都相對較差，而通過對良種動物反復進行活體采卵可獲得大量種質優(yōu)良的卵母細胞，其胚胎生產(chǎn)的效率要比超數(shù)排卵高出數(shù)倍，且對動物的生產(chǎn)性能和生殖機能無太大影響。（1）腹腔鏡法

在腹壁切開一小口,插入腹腔鏡、操作桿和穿刺針,通過操作桿和穿刺針的配合將卵母細胞抽吸出來。該法的優(yōu)點是比較直觀,容易掌握；缺點是工作量大,對母牛有損傷,不能頻繁手術。（2）B超引導法

將帶有超聲波探頭和采卵針的采卵器插入到陰道子宮頸的一側穹隆處，術者通過直腸將卵巢貼在探頭上，根據(jù)B超屏幕上所顯示的卵泡位置進行穿刺而將卵泡抽出。該法的優(yōu)點是不用手術，操作的速度較快，對母牛的損傷較少，可頻繁對母牛進行采卵，亦可對妊娠母牛進行采卵；缺點是操作技術較難掌握，并需要昂貴的超聲設備。據(jù)研究報道，母?？擅恐懿陕?次，每次可獲得5~6枚卵母細胞，且持續(xù)2~3個月對母牛無不良影響。（二）卵母細胞的體外成熟1．培養(yǎng)液

用于卵母細胞體外成熟的基礎培養(yǎng)液有TCM199，Ham’sF-10，Menezo’sB2，NUSC23和MEM等，其中應用最廣泛的是TCM199。這些基礎培養(yǎng)液上需添加一定濃度的血清（5~10%的FCS或ECS）和促性腺激素等成分。激素對卵母細胞體外成熟的作用不確定：在有血清存在的條件下，激素對卵母細胞體外成熟的作用不大，濃度過高反而有一定的副作用；但在無血清存在的條件下，激素則對卵母細胞的受精能力和胚胎發(fā)育能力均有一定促進作用。2．培養(yǎng)時間

對大多數(shù)家畜來講，卵母細胞的成熟培養(yǎng)時間一般采用22~24小時，但豬多采用40~44小時，馬多采用30~36小時。時間過短，雖然卵母細胞已達核成熟，但細胞質尚未充分成熟；而培養(yǎng)時間過長，勢必因卵母細胞的代謝底物不足而影響其活力，最終導致受精率和胚胎發(fā)育率下降。

3．溫度和氣相

人和嚙齒類動物的卵母細胞體外成熟采用37℃，牛、豬、羊和馬等家畜的卵母細胞成熟培養(yǎng)溫度均采用38~39℃。研究表明，牛卵母細胞在38.5℃培養(yǎng)16小時后再在37℃培養(yǎng)8小時可以提高其分裂率和囊胚發(fā)育率。由于目前采用的培養(yǎng)液大都以HCO3-作為酸堿緩沖體系，故需維持一定濃度CO2的氣相環(huán)境來保持培養(yǎng)液的酸堿度，否則會因為培養(yǎng)液中CO2的逸出而使培養(yǎng)液的pH升高，一般采用5%的CO2。

4．培養(yǎng)系統(tǒng)

卵母細胞的成熟培養(yǎng)系統(tǒng)大致可分為：

（1）開放培養(yǎng)系統(tǒng)

將1~2ml成熟培養(yǎng)液直接置于平皿內或五孔培養(yǎng)板內，然后放入50~200枚卵母細胞進行培養(yǎng)，上面不蓋石蠟油。該系統(tǒng)的優(yōu)點是簡單，對培養(yǎng)液中的脂溶性物質沒有影響，且同時能培養(yǎng)大量的卵母細胞；缺點是滲透壓的變化較大，容易污染，故培養(yǎng)液的量和培養(yǎng)向內的濕度要特別注意。該系統(tǒng)根據(jù)平皿的運動狀態(tài)分為靜止培養(yǎng)系統(tǒng)和搖動培養(yǎng)系統(tǒng)兩種，如采用靜止培養(yǎng)系統(tǒng)時應在成熟培養(yǎng)液中加入一定濃度的FSH(0.1ug/ml),否則會因卵母細胞的嚴重貼壁而使卵母細胞變形。

（2）微滴培養(yǎng)系統(tǒng)

將成熟培養(yǎng)液先在組織培養(yǎng)皿中做成50~500ul的微滴，上覆石蠟油，然后將卵母細胞置于其中培養(yǎng)。該系統(tǒng)的優(yōu)點是成熟培養(yǎng)液中的滲透壓比較穩(wěn)定，且不易污染；缺點是對培養(yǎng)液中的脂溶性物質有稀釋作用，且成本較高，培養(yǎng)結果易受石蠟油影響。此法適用于多組對比實驗，或來源于不同母畜的卵母細胞的分別培養(yǎng)等。

（3）密閉培養(yǎng)系統(tǒng)

將卵母細胞置于含有1~2ml成熟培養(yǎng)液的試管中，加蓋膠塞，然后在培養(yǎng)箱或恒溫水浴中培養(yǎng)；如若采用培養(yǎng)皿或微滴培養(yǎng)，則可將其裝入一個密閉的塑料袋中。該法的優(yōu)點是不需要CO2培養(yǎng)箱，方便運輸；缺點是pH不如前者穩(wěn)定。

三．卵子和精子的體外受精（一）精子的制備

精液中含有大量的精漿和精子獲能的抑制因子，在體外受精前必須將其去掉。如是冷凍精液，其中還含有防凍劑和蛋黃等成分，這些成分將可能干擾正常受精過程，受精前亦有必要將其去掉。此外，精子的活力亦是影響體外受精的重要因素之一，過多的死精子留在受精液中將不利于卵母細胞的受精完成，也應將其去掉。因此，精子的分離于制備實體外受精激素的一個關鍵環(huán)節(jié)。

1．懸浮法

將精液置于含有1~5ml獲能液或受精液的試管底部，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10~30min后,吸取上層液體,而后離心洗滌1~2次,即可獲得高活力的潔凈精子。此法適用于精子活力較差的精液,但精子往上游動不充分,利用率低,對于價格昂貴的優(yōu)良種畜精液應慎重考慮。

2．玻璃棉過濾法

許多實驗室采用小玻璃珠柱層過濾法來濾除已稀釋牛精液中的死精子，此法可大大節(jié)約精子的制備時間，但器材較昂貴。

3．哌可（Percoll）密度梯度離心法

根據(jù)形態(tài)正常精子的密度高于異常的精子,經(jīng)平衡離心后形態(tài)正常的獲能精子將集中于高密度的哌可區(qū),從而分離的到高受精力的精子。常用的哌可密度梯度為30%和45%,平衡離心10min,梯度離心法可分離得到更高質量的精子,且精子的利用率也較高。但哌可梯度離心法分離得到精子的體外受精效果易受哌可質量影響。

4．離心洗滌法

取0.1~0.2ml的精液放入含有5~10ml的獲能液或受精液的離心管中，而后離心2次即可。此法的優(yōu)點是操作簡單，精子的利用率高。但需在受精前估算精子的活力，因為從此法獲得的精子沒有經(jīng)過活精子的篩選。

（二）精子的獲能

1．肝素處理法

此法是目前應用廣泛的精子獲能處理方法。將一定濃度的肝素直接添加到受精液中進行受精，受精液中的肝素濃度一般為2~10ug/ml，應注意的是，不同的動物要求不同濃度的肝素。

2．鈣離子載體法

鈣離子載體A23187可直接誘發(fā)Ca2+進入精子細胞內，提高細胞內的Ca2+濃度，從而引起精子獲能。處理方法是，首先將精子加入含有0.5~1.0umol/L的不含的受精液中處理約5min，然后加入等量的含1%BSA的受精液，以終止A23187的作用，隨后精子可用于體外受精。

3．高滲溶液處理法

據(jù)報道，當精子與高滲溶液作用時，精子表面富含的被膜蛋白將脫落，從而導致精子獲能。一般用的高滲溶液為360~380mosm。雖然如此高滲的溶液對精子有一定的高滲打擊，但受精效果不錯，故至今仍有人使用此法。

4．卵泡液處理法

卵泡液含有來自血清的大分子物質，且含有誘發(fā)精子獲能和頂體反應的因子，故在培養(yǎng)液中加入一定濃度的卵泡液將有可能誘發(fā)精子的獲能。但卵泡液含有精子活動的抑制因子，因此，卵泡液可用于精子的獲能處理，但不能用于體外受精系統(tǒng)。

5．血清白蛋白溶液孵育

血清白蛋白是血清中的大分子物質，具有很強的結合膽固醇和鋅離子的能力，可除去精子質膜中的部分膽固醇和鋅離子，降低膽固醇在精子質膜中的比例，進而改變精子質膜的穩(wěn)定性，導致精子獲能。但該法需要時間較長，且誘發(fā)精子獲能的作用不強，目前僅作為精子獲能的一種輔助手段。

（三）受精方法1．微滴法

此法是目前應用最為廣泛的一種受精方法。其做法是先在培養(yǎng)皿中用受精液制作成20ul或40ul的微滴并覆蓋石蠟油，置于CO2培養(yǎng)箱中平衡至少2小時。然后，每滴放入10~20枚已培養(yǎng)成熟的卵母細胞和經(jīng)處理的精子，精子在受精液滴中的最終濃度一般為1~2×106ml。應指出的是，不同的公牛要求不同的精子濃度。

2．四孔培養(yǎng)板法

首先在四孔培養(yǎng)板的每孔中放入0.5~1.0ml的受精液，置于CO2培養(yǎng)箱中平衡至少2小時。然后，每孔放入50~100枚已培養(yǎng)成熟的卵母細胞和經(jīng)處理的精子，精子在受精液滴中的最終濃度同上。

3、精子顯微注射受精

（1）卵子的收集和處理

目前用于顯微注射的卵可以通過激素超排的方法獲得，也可采用體外成熟的卵子。卵母細胞在注射前采用0.1%透明質酸酶除去卵丘細胞，對于脂肪含量較多的牛和豬卵母細胞，還應對其進行離心處理，以便使卵母細胞中的脂肪滴被甩向一側，胞質變的透明，便于注射的操作。

（2）精子或精核的制備

精子注射前，要對其進行孵育獲能處理。如果注射的是精子的頭，則需要對其進行超聲波處理和蔗糖密度梯度離心分離精子的頭。制備好的精子可單獨置于含有8%~10%聚乙烯吡咯烷酮或甲基纖維素的操作液微滴中。此外,可在精子注射的操作液中加入5mmol/L的二硫蘇糖醇,可使注入卵胞質的精核更易發(fā)生解聚。

（3）精子或精核的顯微注射

目前用于精子顯微注射的方法有常規(guī)和壓電子素微操作法，兩者主要在注射管及驅動動力上有區(qū)別。前者需要斜口針，且要拉一針尖，后者使用平口針即可。

（4）卵子的激活

目前激活卵母細胞常用的方法有鈣離子載體A23187處理、電激、酒精處理、離子霉素+6二甲氨基嘌呤(6-DMAP)、離子霉素+放線菌酮(CHX)等。目前，較為有效的激活方法是先用5umol/L的離子霉素激活處理卵子5min，然后在含有2mmol/L6-DMAP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3小時。

四、早期胚胎的體外培養(yǎng)

（一）培養(yǎng)液

早期胚胎的體外培養(yǎng)液一般可分為簡單培養(yǎng)液和復合培養(yǎng)液。簡單培養(yǎng)液，如CR1液、BMOC-3液.CZB液和SOF(syntheticoviductfluid)液等，復合培養(yǎng)液，如TCM199、CMRL1066、HamF-10液等。所有培養(yǎng)液的基本成分主要包括無機鹽、碳水化合物、氨基酸、蛋白質、維生素及其他的生長因子等。按其功用可分為滲透壓維持因子、代謝底物和代謝調節(jié)因子。

1、培養(yǎng)液中的無機鹽主要包括Na+、Cl-、K+、Mg2+、Ca2+、PO43-、SO42-和HCO32-等。Na+、Cl-調節(jié)滲透壓。2、能量底物亦是胚胎培養(yǎng)液中的一種重要成分，包括葡萄糖、乳酸鈉、丙酮酸鈉和谷氨酰胺等。氨基酸是蛋白質合成的前體，同時也參與胚胎的能量代謝。3、維生素作為碳水化合物和氨基酸代謝過程中必不可少的成分，能促進細胞對葡萄糖的攝取和乳糖的合成，從而影響胚胎的代謝和發(fā)育。4、在培養(yǎng)液中添加一定比例的生物體液和蛋白質對胚胎的發(fā)育也有促進作用。5、激素是胚胎發(fā)育的調節(jié)因子，激素對胚胎體外發(fā)育的影響具有明顯的階段性。據(jù)研究，在培養(yǎng)液中添加生長因子，能增加胚胎的細胞數(shù)和提高胚胎的質量。而環(huán)一磷酸腺苷幾乎是所有激素作用的細胞內信號轉導因子，它們對細胞的作用更為直接,與激素的受體存在與否無關。

（二）體外培養(yǎng)系統(tǒng)

1．常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)

將胚胎單獨培養(yǎng)在培養(yǎng)液中，不添加任何其他細胞及其分泌因子。常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)又分為微滴法和培養(yǎng)板法。微滴法是在塑料培養(yǎng)皿中制作30~100ul的微滴，上覆石蠟油，然后將胚胎置于其中培養(yǎng)。該法適用于數(shù)量較少的胚胎培養(yǎng)，因較少培養(yǎng)液體積容易建立一個有利于胚胎發(fā)育的微環(huán)境。如若胚胎數(shù)量較多，可采用四孔培養(yǎng)板法，即將胚胎直接置于含有500~800ul培養(yǎng)液的四孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)這樣操作相對較簡單。丹麥胚胎技術中心建立了一種WOWs培養(yǎng)方法，可用四孔板培養(yǎng)小量的胚胎。具體做法為，用針將培養(yǎng)板的底部鑿成許多直徑為15