綜合性實驗：

流式細胞術(shù)檢測細胞DNA含量山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院邢維賢實驗原理流式細胞術(shù)（flowcytometry）是利用流式細胞儀（flowcytometer）對懸浮細胞或微粒進行快速、多參數(shù)分析的現(xiàn)代細胞分析技術(shù)，能夠同時定量檢測單個細胞的多項指標(biāo)。流式細胞儀的發(fā)展起源于對細胞計數(shù)自動化的研究。1934年，moldvan報道了對流動的細胞如紅細胞、染色后的酵母菌的檢測方法。1947年，Gucker等首次采用了鞘液原理對氣體中的微粒進行計數(shù)。1953年，Crosland-Taylor成功設(shè)計了鞘液系統(tǒng)。將待測的細胞懸液緩慢的注入一個快速流動的液流中，使該細胞液包繞在細胞懸液的外側(cè)，形成鞘流（sheathflow），而細胞懸液始終處于軸流狀態(tài)。根據(jù)牛頓流體在圓形管中流動規(guī)律的認(rèn)識：鞘流速度越快，載物通過的能力越強，并且具有較強的流體動力聚集作用，據(jù)此，設(shè)計了流動室。實驗原理1956年，coulter原理：在一個微孔兩側(cè)充滿電解質(zhì)溶液，通電時電流通過微孔，在壓力系統(tǒng)控制下細胞或者顆粒流過微孔時，使微孔的截面積減小，由于細胞或顆粒的電阻與電解質(zhì)相差較大，可以檢測出微孔兩側(cè)電壓變化脈沖，電脈沖的強度和個數(shù)則可以獲得有關(guān)細胞大小和數(shù)目的信息?，F(xiàn)代流式細胞術(shù)對數(shù)據(jù)采集和分析的技術(shù)是從組織化學(xué)發(fā)源的，Kamentsky在組織化學(xué)的基礎(chǔ)上提出了兩個新的設(shè)想（1）細胞的組分是可以通過分光光度學(xué)來定量測量的；（2）細胞的不同組分可以同時進行多參數(shù)測量，從而可以對細胞進行分類。因此，對同一細胞可以同時獲得有關(guān)不同組分的多方面信息，以此作為鑒別細胞的依據(jù)。實驗原理VanDilla和LosAlamos小組在1967年研制出液流束、照明光軸、檢測細胞光軸三者相互正交，這是流式細胞計的基礎(chǔ)。首次采用Feulgen反應(yīng)對DNA染色顯示出DNA的活性與熒光之間存在著線性關(guān)系，并能夠在DNA直方圖上清楚的顯示出細胞周期的各個時相。1972年，LenHerzenberg等人在斯坦福大學(xué)研制出一臺熒光激活細胞分選儀（fluorescence-activatedcellsorter,FACS），它標(biāo)志著流式細胞儀商品化時代的到來。流式細胞儀的結(jié)構(gòu)

StructureofFlowCytometer

流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)流式細胞儀激光光源激光束成形系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成信號監(jiān)測、存貯、顯示、分析系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng)

流動室和液流驅(qū)動系統(tǒng)

FlowChamber(FlowCell)將待測細胞制成單細胞懸液，用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，從而使鞘液能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。激光光源與光束成形系統(tǒng)

Laser,lightamplificationbystimulatedemissionofradiation流式細胞儀以激光作為發(fā)光源，經(jīng)過聚焦后產(chǎn)生的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。前向角散射（FSC），與細胞直徑正相關(guān)，常以此做閾值，排除碎片及其它顆粒，避免干擾。側(cè)向角散射（SSC），與激光束正交90度方向的散射信號，它對細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核膜的折射率更敏感，可以提供細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和顆粒的信息。僅僅根據(jù)FSC/SSC就可以區(qū)分外周血中的淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞。光學(xué)系統(tǒng)FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成。它們分別將不同波長的熒光信號送入到不同的電子探測器。在FCM的光學(xué)系統(tǒng)中最主要的光學(xué)元件是濾光片，主要有三類：長通濾片（LP）、短通濾片(SP)和帶通濾片(BP)。信號檢測與分析系統(tǒng)

SignalScanandAnalysis熒光信號的面積和寬度1、所謂熒光信號的面積是采用對熒光光通量進行積分測量，一般對DNA倍體測量采用面積，這是因為熒光脈沖的面積比熒光脈沖的高度更能準(zhǔn)確反映DNA的含量。2、熒光信號的寬度常用來區(qū)分雙聯(lián)體細胞。3、通過設(shè)“門”可以將雙聯(lián)體細胞排除，其原理是雙聯(lián)體細胞所得到的熒光寬度信號（FL-W）要比單個G2期細胞大，因此射門后才能得到真正的DNA含量分布曲線和細胞周期。常用的熒光標(biāo)記染料流式細胞術(shù)的數(shù)據(jù)表示形式實驗儀器及材料實驗儀器：流式細胞儀partec-cyflow實驗材料：Hela細胞實驗試劑：磷酸鹽緩沖液、PI染液實驗步驟制備單細胞懸液，細胞計數(shù)調(diào)整為1X106個/ml。加入PBS，300-400g離心5min。棄上清加入70%乙醇，4℃固定過夜。離心，棄乙醇，加入PBS重懸。篩網(wǎng)過濾，離