神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞與電生理學(xué)研究方法

一、神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞二、電生理學(xué)方法介紹醫(yī)學(xué)院生理學(xué)研究所李景新88383902一、神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞1.神經(jīng)元軸突內(nèi)神經(jīng)活動的電變化Measuringtherestingmembranepotential1)電信號MethodsofRecordingActionPotentials1)電信號神經(jīng)纖維靜息電位與動作電位波形與產(chǎn)生機(jī)制Thevoltage-gatedchannelStructureofthevoltage-gatedsodiumchannel2.神經(jīng)元-神經(jīng)元間化學(xué)性突觸傳遞SynapticarrangementsintheCNSVarioussizesofCNSsynapses2.神經(jīng)元-神經(jīng)元間化學(xué)性突觸傳遞2.神經(jīng)元-神經(jīng)元間化學(xué)性突觸傳遞Amembraneionchannel?Theproperties:ionselectivityandgating.Amembraneionchannel?Theproperties:ionselectivityandgating.TransmitteractionsatG-protein-coupledreceptors.

ThebindingofneurotransmittertothereceptorleadstotheactivationofG-proteins.ActivatedG-proteinsactivateeffectorproteins,whichmaybe(a)ionchannelsor(b)enzymesthatgenerateintracellularsecondmessengers.二、電生理學(xué)方法細(xì)胞外紀(jì)錄(extracellularrecording):細(xì)胞內(nèi)紀(jì)錄(intracellularsingleunitrecording)：電壓鉗（voltageclamp）膜片鉗（patchclamp）

腦電圖(EEG)誘發(fā)電位（evokedpotential）

微電泳（microelectrophoresis）

抗體微量注射

正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)磁共振成像術(shù)

（1)

陰極射線示波器（oscillograph）：

（2）生物電放大器(amplifier):

頻率相應(yīng)范圍大（通頻帶從0~100kHz)，有足夠高的放大能力，低噪聲，高輸入阻抗，高的辨差比。（3）電子刺激器（electronicstimulator）:矩形脈沖：刺激強(qiáng)度（幅度:最大瞬時值，0.001~200V之間，連續(xù)可調(diào)）、時間（波寬：10s~1s）、頻率(波寬和延遲時間之和小于頻率的倒數(shù))、延遲；刺激方式：單，連續(xù)，雙脈沖刺激；同步輸出：觸發(fā)其他需要與刺激同步的儀器（示波器，微電泳，照相等）一起工作。刺激隔離器（insulator）。（4）

儲存和分析電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果的儀器：

常用的主要儀器

電記錄的技術(shù)(A)細(xì)胞外記錄法記錄法記錄單個細(xì)胞或一群細(xì)胞的電活動。(B)微電極細(xì)胞內(nèi)記錄法記錄膜內(nèi)外的電位差：靜息電位和動作電位。(C)膜片鉗記錄法記錄當(dāng)膜上單個通道開啟或關(guān)閉時的電流。?工作原理：把引導(dǎo)電極安放在神經(jīng)組織的表面或附近引導(dǎo)神經(jīng)組織的電活動?；顒硬课坏纳窠?jīng)元去極化，未活動部位極化狀態(tài)，在容積導(dǎo)體中兩部位電位不同，電流流動，放置在細(xì)胞表面的電極會紀(jì)錄出兩者間的電位差。?優(yōu)點(diǎn)：方便，電極不插入細(xì)胞。?特點(diǎn)：細(xì)胞外電位的波形因記錄細(xì)胞的不同部位而異

細(xì)胞外紀(jì)錄(ExtracellularRecording)Wangetal.,JCompNeurol,2001膈神經(jīng)及呼吸相關(guān)神經(jīng)元放電記錄細(xì)胞內(nèi)紀(jì)錄IntracellularSingleUnitRecording細(xì)胞內(nèi)紀(jì)錄

IntracellularSingleUnitRecording

由于插入神經(jīng)元內(nèi)胞體并記錄細(xì)胞內(nèi)電位的微電極技術(shù)的發(fā)展，Eccles等首先將微電極插入脊髓運(yùn)動神經(jīng)元的胞體，記錄哺乳類動物脊髓的大運(yùn)動神經(jīng)元胞內(nèi)電位。?運(yùn)動神經(jīng)元的胞體直徑70m;?微電極尖端直徑0.5m；?跨膜電位差60~80mV。圖用微電極在貓脊髓運(yùn)動神經(jīng)元內(nèi)記錄的突觸后電位A.B.C:三種不同的閾下刺激；D:10次刺激引起的峰電位。圖刺激神經(jīng)在單根肌纖維的終板上所誘發(fā)的電位a.正常終板電位和相繼發(fā)生的肌肉峰電位；b,c,d,e:箭毒進(jìn)行性地阻滯肌反應(yīng);e只留下終板電位，神經(jīng)肌肉傳遞被箭毒阻滯了。圖槍烏賊星狀神經(jīng)節(jié)的突觸前纖維表現(xiàn)的動作電位和在突觸后神經(jīng)元誘發(fā)的局部電位。

20世紀(jì)50年代，HodgkinandHuxley首次應(yīng)用電壓鉗技術(shù)對槍烏賊的標(biāo)本進(jìn)行膜電流的測定。?工作原理：離子流過通道所形成的離子流是形成動作電位的基礎(chǔ)。電生理實(shí)驗(yàn)以電流作為刺激源，使可興奮細(xì)胞產(chǎn)生興奮，然后測定其膜電壓以確定離子通道的狀態(tài)。但在形成動作電位時所產(chǎn)生的離子流可影響膜電位，而膜電位的變化又會影響該離子的通透性的變化。因而，須人為地使膜電位在一定時間內(nèi)維持在一個固定水平。電壓鉗技術(shù)是通過插入細(xì)胞內(nèi)的一根微電極人為向胞內(nèi)補(bǔ)充電流，補(bǔ)充的電流正好等于跨膜流出的反相離子電流（大小相等方向相反）。?意義

：1）確保膜通透性發(fā)生改變時，控制膜電位始終維持在指令電位的水平；2）通過電流檢測裝置，記錄到補(bǔ)充入胞內(nèi)的注入電流，它相當(dāng)于離子電流的反相電流。這樣可測定在不同膜電位水平的離子電流，了解膜通道的電導(dǎo)及功能活動。電壓鉗voltageclamp應(yīng)用：定量分析刺激與細(xì)胞后膜電導(dǎo)的變化。反映整個細(xì)胞膜上所有通道活動的綜合結(jié)果。不足：此項(xiàng)技術(shù)不能了解單個離子通道的功能活動狀態(tài)。另外，牽制的面積大，包含大量的隨機(jī)開放和關(guān)閉的通道，形成的背景噪音也大，掩蓋單一通道的微弱電流，另外，小神經(jīng)元插入兩個電極不容易。電壓鉗裝置圖和電壓鉗實(shí)驗(yàn)記錄的膜電流?1976年由德國Neher和Sakmann發(fā)明（1991NobelPrize）。?工作原理：同電壓鉗，即在人為設(shè)置電壓并固定的情況下記錄分析離子通道。膜片鉗技術(shù)使用玻璃微電極吸管把只含1-3個離子通道、面積為幾個mm2的細(xì)胞膜通過負(fù)壓吸引封接起來。由于電極尖端與細(xì)胞膜的高阻封接，在電極尖端下的那片膜與膜的其他部分從電學(xué)上隔離。因此，片膜內(nèi)通道開放所產(chǎn)生的電流流進(jìn)玻璃吸管，用一個極為敏感的膜片鉗放大器測量此電流強(qiáng)度，即代表單一離子通道電流。?性能：電極尖端(1~5m)與膜之間電阻109

（G,10G~100G）的高封接（giga-seals）,大大提高了膜片鉗的可靠性和靈敏性，可測量0.06pA的電流，1m的空間分辨力和10s時間的分辨力。?意義：膜上電壓依賴型離子通道有開與關(guān)兩種電導(dǎo)狀態(tài)。通道膜片鉗技術(shù)可直接觀察離子通道“開啟”和“關(guān)閉”。膜片鉗PatchClampPatchclampingrecordioniccurrentsthroughsinglechannels?Thepatchcontainsavoltage-gatedNa+channel,?Changingthemembranepotentialfrom–65mVto–40mV,?Causethechanneltoopen,andcurrent(I)willflowthroughit(e).?Theamplitudeofthemeasuredcurrent

ataconstantmembranevoltagereflectsthechannelconductance,andthedurationofthecurrentreflectsthetimethechannelisopen.b.Applyingsuctionthroughtheelectrodetip.c.Withdrawtheelectrodefromthecell,themembranepatchwastornaway.d.Ioniccurrentswasmeasuredassteadyvoltagesacrossthemembrane.a.Aglasselectrodeontothemembraneoftheneuron.TheopeningandclosingofNa+channelsuponmembranedepolarization(a)Theelectricalpotentialacrossapatchofmembrane.Whenthemembranepotentialischangedfrom–65~-40mV,theNa+channelspopopen.(b)Threedifferentchannelsrespondtothevoltagestep.(c):AmodelforhowchangesintheconformationoftheNa+channelproteinmightyielditsfunctionalproperies.Theshortcutpathwaya)G-proteinsinheartmuscleareactivatedbyAChbindingtomuscanrinicreceptors.b)TheactivatedGsubunitdirectlygatesaK+channel.Apatch-clamprecordingfromatransmitter-gatedionchannel.Ioniccurrentpassesthroughthechannelswhenthechannelsareopeninthepresenceofneurotransmitter.IbuprofenInhibitsCysticFibrosisTransmembraneConductanceRegulator–mediatedClSecretion原理:

應(yīng)用光學(xué)記錄技術(shù)，把特別研制的熒光染料與細(xì)胞膜結(jié)合，在有動作電位發(fā)生時，這種燃料的光吸收特性發(fā)生改變。種類：?正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)（positronemissiontomography,PET）

?磁共振成像術(shù)（magneticresonaceimaging）作用：顯示清醒人的大腦中受刺激區(qū)域，或發(fā)動運(yùn)動時的活動狀態(tài)。神經(jīng)元活動的無創(chuàng)傷技術(shù)正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)PositronEmissionTomography,PET腦功能性磁共振成像術(shù)MagneticResonaceImaging功能性磁共振成像技術(shù)檢測視皮層的功能活動A未刺激時組織的去氧血紅蛋白比例高；B.刺激后組織氧合血紅蛋白增高；C.視覺刺激后腦影像視皮層活動區(qū)。OnimaruandHomma,JNeurosci,2003RespiratoryPacemakingNeuronsinParafacialArea突觸前神經(jīng)末梢的遞質(zhì)以量子式釋放，量很微少。因此在進(jìn)行神經(jīng)遞質(zhì)功能測定時，只能用最小而有效的劑量模擬神經(jīng)遞質(zhì)的生理功能。這是與藥理學(xué)方法明顯的區(qū)別。藥理學(xué)研究可能用很大的劑量，所引起的效應(yīng)可能與生理效應(yīng)不同甚至相反。

微電泳（microelectrophoresis）

抗體微量注射神經(jīng)遞質(zhì)功能測定的生理學(xué)方法?定義：借助微電極通過一定的電流將解離物質(zhì)電泳到神經(jīng)元附近，觀察神經(jīng)遞質(zhì)或其他藥物對該神經(jīng)元的作用。?基本原理：外加電流通過含解離物質(zhì)溶液的微電極時，將微電極內(nèi)的解離物質(zhì)從管尖釋放出來。例如微電極接正極，動物頭皮接負(fù)極時，帶陽離子的物質(zhì)從微電極中釋出。相反，微電極接負(fù)極，頭皮接正極時，帶負(fù)離子的物質(zhì)從微電極釋出。微電泳時解離物質(zhì)從微電極釋出量，與它通過的電荷量成正比。因此，通常用微電極的電流強(qiáng)度表示解離物質(zhì)的釋放量