植物遺傳轉(zhuǎn)化的策略與方法楊清植物轉(zhuǎn)基因研究概況遺傳轉(zhuǎn)化的策略遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法植物轉(zhuǎn)基因現(xiàn)狀1983年比利時根特大學(xué)Montagu實驗室、孟山都公司Fraley領(lǐng)導(dǎo)的研究小組、華盛頓大學(xué)Chilton的研究室首次將外源基因轉(zhuǎn)入煙草、胡蘿卜。到1993年，世界上轉(zhuǎn)基因成功的植物就已突破60種，至今已有35科120多種植物轉(zhuǎn)基因獲得成功。從1986年首批轉(zhuǎn)基因植物被批準(zhǔn)進入田間試驗，至今國際上已有30個國家批準(zhǔn)數(shù)千例轉(zhuǎn)基因植物進入田間試驗，涉及的植物種類有40多種。主要包括延熟番茄,抗除草劑的玉米、棉花、大豆和油菜,抗蟲的馬鈴薯、棉花和玉米,抗病毒的西葫蘆、南瓜和番木瓜,雄性不育的玉米和萵苣,以及改變油脂特性的油菜和大豆等。1987年我國首次獲得轉(zhuǎn)Ｂt基因的煙草和番茄以來，相繼獲得了轉(zhuǎn)Ｂt基因的棉花、水稻、玉米等。我國目前正在研究的轉(zhuǎn)基因植物有47個種，涉及的各類基因103個。遺傳轉(zhuǎn)化的策略按目的基因數(shù)量單基因轉(zhuǎn)化雙基因轉(zhuǎn)化多基因轉(zhuǎn)化(同源重組構(gòu)建多基因雙元載體)Multiple-roundinvivosite-specificassemblyMultiRoundGateway多聚蛋白酶解法依賴歸巢酶的pRCS/pAUX和

pSAT載體系統(tǒng)Cre/loxP位點特異重組系統(tǒng)MultiSiteGateway(常規(guī)的)酶連重組法BiBAC/TAC大分子量DNA轉(zhuǎn)化法多基因轉(zhuǎn)化方法連續(xù)再轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)基因植物雜交聚合法多載體共轉(zhuǎn)化法多基因載體轉(zhuǎn)化法

多重同源重組法:一種基于同源重組構(gòu)建多基因雙元載體的方法(張興國)按目的基因?qū)胛恢眉毎巳~綠體按啟動子的類型組成型啟動子特異性啟動子遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化基因槍法電擊法注射法化學(xué)藥劑誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化花粉管通道法根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)外植體+農(nóng)桿菌共培養(yǎng)芽誘導(dǎo)抗生素篩選生根培養(yǎng),植株再生分子檢測,轉(zhuǎn)基因植株獲得技術(shù)特點：轉(zhuǎn)化拷貝數(shù)低攜帶目的基因片段大整合后外源基因結(jié)構(gòu)變異小操作簡便等優(yōu)點該技術(shù)已成為轉(zhuǎn)化成功最多的一種轉(zhuǎn)化方法基因槍法(particlegun)又稱微彈轟擊法(microprojectilebombardment或particlebombardment)。該法借助高速運動的金屬粒子將附著于其表面的核酸分子引入受體細胞，外源基因進入受體細胞核后整合到染色體組，然后通過組織培養(yǎng)再生出完整個體(植株)。優(yōu)點：受體材料來源廣泛靶受體類型廣泛縮短了轉(zhuǎn)基因周期、轉(zhuǎn)基因植株變異率低及通常具有正常的育性缺點：轉(zhuǎn)化效率不高多拷貝插入費用較高電擊法又稱電穿孔法(electroporation)。在高壓電脈沖作用下，使新鮮分離的原生質(zhì)體質(zhì)膜形成可逆性瞬間通道，外源DNA穿過通道進入細胞，并整合到染色體組。

優(yōu)點：不受宿主限制操作簡便對植物細胞不產(chǎn)生毒性轉(zhuǎn)化效率較高，特別適于瞬間表達缺點：易造成原生質(zhì)體的損傷存在原生質(zhì)體再生困難注射法開始用于動物卵細胞，后來被用于植物。用顯微注射儀把外源DNA溶液注入到子房或胚囊中，由于子房或胚囊中產(chǎn)生高的壓力及卵細胞的吸收，使外源DNA進入受精的卵細胞中，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。對于子房大、多胚珠的作物，可以說是一種簡便可行的轉(zhuǎn)化途徑?；瘜W(xué)藥劑誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化

常用的化學(xué)誘導(dǎo)劑：聚乙二醇(PEG)多聚鳥氨酸(PLO)聚乙烯醇(PVA)PEG是一種細胞融合劑。PEG法是最常用的化學(xué)基因轉(zhuǎn)化方法,它是將Ti質(zhì)粒與原生質(zhì)體共同培養(yǎng)在含有PEG和Ca2+的溶液中，在高pH值條件下,原生質(zhì)體攝取外源DNA分子,然后經(jīng)再生獲得轉(zhuǎn)基因植株。優(yōu)點：不受宿主范圍的限制操作簡便成本底缺點：一般只適用于原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，而原生質(zhì)體再生植株并不容易，轉(zhuǎn)化效率低;再生植株常不可育或形態(tài)異常、多拷貝插入等現(xiàn)象?；ǚ酃芡ǖ婪ɡ瞄_花植物授粉后形成的花粉管通道，直接將外源目的基因?qū)肷胁痪邆湔＜毎诘穆?、合子或早期胚胎細胞，實現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)化。步驟：１）去除花冠;２）用微量注射器從斷面沿花柱中軸插入子房長度的約１／４處，再退回２毫米左右;３）注入含外源目的基因的緩沖液;４）正常管理，收獲種子,經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株。技術(shù)特點：直接、簡便易行;不需要組織培養(yǎng)的繼代，從而排除了植株再生的障礙；但轉(zhuǎn)化效率較低；適合于花器官較大的植物。小結(jié)

雖然有不同轉(zhuǎn)基因方法，但使用最為廣泛的方法仍是農(nóng)桿菌法和基因槍法兩種方法。轉(zhuǎn)化方法的選擇，取決于植物種類和實驗室自身具備的條件。遺傳轉(zhuǎn)化實例類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶

3GT基因馬鈴薯塊莖中的特異表達受體材料:

馬鈴薯品種Desiree目標(biāo)基因