實(shí)驗(yàn)三線粒體及葉綠體的提取第一頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日分離葉綠體和線粒體的意義1.分離和制備有活性的離體葉綠體是研究葉綠體的結(jié)構(gòu)功能、光合作用原理及遺傳控制機(jī)理的前提。2.對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)與功能的研究通常是在離體的線粒體上進(jìn)行的。第二頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握差速離心技術(shù)分離細(xì)胞器的一般原理和方法。2.對(duì)分離得到的葉綠體及線粒體進(jìn)行觀察及活性鑒定。第三頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)原理1.差速離心勻漿、超聲、研磨使細(xì)胞膜破裂，釋放各種細(xì)胞器在一定的離心力下，不同細(xì)胞器的沉降速度不同。用不同的離心力，將各種不同亞細(xì)胞組分分離。第四頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞核/葉綠體、線粒體/溶酶體/過氧化物酶體、微體、核糖體等。由于細(xì)胞核與葉綠體的沉降速度相近，二者通過離心的方法較難分離。第五頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日2.細(xì)胞器的分離介質(zhì)和條件采用緩沖溶液,接近細(xì)胞質(zhì)的分散相,保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性；葉綠體用0.35M氯化鈉或0.4M蔗糖溶液；線粒體用0.25M蔗糖溶液；整個(gè)操作過程樣品要保持在0℃-4℃,避免酶失活。第六頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日3.對(duì)分離的細(xì)胞器進(jìn)行鑒定葉綠體用0.01%吖啶橙熒光染料線粒體用1%詹納斯綠B染液鑒定活性和純度。第七頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)材料（一）器材：

普通離心機(jī),研缽,天平,

載玻片,蓋玻片,濾紙,試管,試管架,移液管,滴管,

燒杯,離心管（二）材料：菠菜葉片,玉米黃化苗（三）試劑：提取緩沖液：2mMNa2-EDTA;50mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸緩沖液(pH7.4),0.5%BSA(用前加入)0.35M氯化鈉-提取緩沖液,0.25M蔗糖-提取緩沖液，1%詹納斯綠B(JanusgreenB)染液0.3M甘露醇溶液第八頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)步驟.菠菜葉綠體的分離1.選取新鮮的菠菜嫩葉，洗凈擦干后去除葉梗及粗脈，稱3g置于研缽中，加入15ml0.35M氯化鈉－提取緩沖溶液。2.研磨成勻漿。3.用6層紗布過濾,濾液盛于燒杯中。4.取濾液12ml在1000r/min下離心2min，棄去沉淀。5.將上清液在3000r/min下離心5min，沉淀即為葉綠體（混有部分細(xì)胞核）。6.沉淀用1ml0.35M氯化鈉－提取緩沖液懸浮。7.取葉綠體懸液1滴置于載玻片上，加蓋玻片后用普通光學(xué)顯微鏡觀察。使用熒光顯微鏡觀察時(shí)，將葉綠體懸液滴在無熒光的載玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙熒光染料，蓋上無熒光的蓋玻片。第九頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日菠菜葉綠體的分離實(shí)驗(yàn)流程圖洗凈、剪碎研磨，過濾兩次離心沉淀懸浮1000rpm2min

取上清3000rpm5min葉綠體15ml0.35M氯化鈉-buffer1ml0.35M氯化鈉-buffer3g菠菜第一步低速離心：去除其中的組織殘?jiān)鸵恍┪幢黄扑榈耐暾?xì)胞光學(xué)顯微鏡第十頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日玉米黃化幼苗線粒體的分離1.玉米幼苗約5克，加三倍體積（約8ml）0.25M蔗糖-提取緩沖液，在預(yù)冷的研缽內(nèi)快速研磨成勻漿。2.8層紗布過濾，濾液經(jīng)4℃

3000g離心10min,去除核和雜質(zhì)。3.上清液用4℃10000g離心10min，沉淀為線粒體。4.沉淀用2

ml0.25M蔗糖-提取緩沖液重懸，同上離心一次(4℃10000g離心10min)。5.沉淀存于200μl0.3M甘露醇中。6.取分離的線粒體滴在載玻片上，滴加1%詹納斯綠B溶液染色10分鐘后,用光學(xué)顯微鏡觀察。第十一頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日玉米黃化幼苗線粒體的分離實(shí)驗(yàn)流程圖玉米黃化幼苗剪碎、研磨，過濾分成小管離心取上清離心沉淀懸浮離心3000g10min10000g10min200μl0.3M甘露醇

5g+8ml0.25M蔗糖-buffer詹納斯綠B溶液染色,觀察4度10000g10min沉淀懸浮第十二頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日注意事項(xiàng)4人/組2人/葉綠體，2人/線粒體注意：離心機(jī)的平衡!請(qǐng)用天平平衡！第十三頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日小型常溫離心機(jī)小型冷凍離心機(jī)第十四頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日小型常溫離心機(jī)小型冷凍離心機(jī)第十五頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日第十六頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日第十七頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日取新鮮葉片，從葉片的下表面撕取表皮制成裝片，在普通顯微鏡及熒光顯微鏡下分別觀察氣孔及氣孔周圍的葉綠體。第十八頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日？？？線粒體詹納斯綠B染色第十九頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日第二十頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日結(jié)果與討論結(jié)果：1.繪圖并描述光鏡下分離的葉綠體的形態(tài)及菠菜下表皮中葉綠體的形態(tài)。2.描述提取到的線粒體的形狀及染色情況（如實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，分析造成實(shí)驗(yàn)失敗的原因。）第二十一頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日思考題1.植物中分離純化的葉綠素的酒精溶液在透射光下為翠綠色，而在反射光下為棕紅色。植物中分離出的葉綠體是否也有同樣的