定量與常規(guī)的差別第一頁，共二十七頁，2022年，8月28日Opticon實時熒光定量PCR儀之如何定量？Ct值的概念Ct值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對應的循環(huán)次數。為什么要用Ct值定量實時熒光定量PCR方法利用循環(huán)閾值（Ct）的概念，在指數擴增的開始階段進行檢測，此時樣品間的細小誤差尚未放大，因此該Ct值具有極好的重復性。第二頁，共二十七頁，2022年，8月28日定量原理初始DNA量越多,熒光達到某一值（域值）時所需要的循環(huán)數越少Log濃度與循環(huán)數呈線性關系，根據樣品擴增達到域值的循環(huán)數就可計算出樣品中所含的模板量確定初始模板的濃度Opticon實時熒光定量PCR儀之第三頁，共二十七頁，2022年，8月28日SYBRGreen1MolecularBeacons

TaqMan熒光化學Opticon實時熒光定量PCR儀之第四頁，共二十七頁，2022年，8月28日AmplifluorRoche熒光化學Opticon實時熒光定量PCR儀之陰陽探針R1R2RQ第五頁，共二十七頁，2022年，8月28日SYBRGreenI工作原理Opticon實時熒光定量PCR儀之SYBRGreen1

結合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen1

染料只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第六頁，共二十七頁，2022年，8月28日GTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT變性DNA未結合SYBRGreen1dye變性:無熒光信號SYBRGreenI工作原理Opticon實時熒光定量PCR儀之第七頁，共二十七頁，2022年，8月28日SYBRGreenI應用范圍起始模板濃度定量融解曲線分析---可區(qū)分單一產物、變異產物、多種產物和（或）引物二聚體基因型分析Opticon實時熒光定量PCR儀之第八頁，共二十七頁，2022年，8月28日SYBRGreenI優(yōu)點使用方便

---不必設計復雜的引物沒有序列特異性

---可以用于不同的模板便宜靈敏Opticon實時熒光定量PCR儀之第九頁，共二十七頁，2022年，8月28日SYBRGreenI缺點與非特異性產物結合Opticon實時熒光定量PCR儀之第十頁，共二十七頁，2022年，8月28日Molecular

BeaconsMolecularBeaconsOpticon實時熒光定量PCR儀之發(fā)夾型雜交探針第十一頁，共二十七頁，2022年，8月28日MolecularBeacons原理：熒光諧振能量傳遞（FRET）

莖由互補配對的序列組成環(huán)與目標序列完全配對莖Opticon實時熒光定量PCR儀之熒光素淬滅劑環(huán)第十二頁，共二十七頁，2022年，8月28日變性:產生非特異性的熒光MolecularBeaconsOpticon實時熒光定量PCR儀之第十三頁，共二十七頁，2022年，8月28日MolecularBeaconsSNPTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQ熒光素目標序列莖淬滅劑Opticon實時熒光定量PCR儀之第十四頁，共二十七頁，2022年，8月28日延伸:沒有熒光MolecularBeaconsSNPOpticon實時熒光定量PCR儀之第十五頁，共二十七頁，2022年，8月28日MolecularBeacons應用范圍定量起始模板濃度基因型分析鑒定產物單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測Opticon實時熒光定量PCR儀之第十六頁，共二十七頁，2022年，8月28日MolecularBeacons優(yōu)點對目標序列有很高的特異性用于SNP檢測的最靈敏的試劑之一熒光背景低Opticon實時熒光定量PCR儀之第十七頁，共二十七頁，2022年，8月28日MolecularBeacons缺點設計困難無終點分析功能只能用于一個特定的目標價格較高Opticon實時熒光定量PCR儀之第十八頁，共二十七頁，2022年，8月28日TaqMan探針熒光素淬滅劑Opticon實時熒光定量PCR儀之TaqMan水解型雜交探針第十九頁，共二十七頁，2022年，8月28日TaqMan目標特異性探針5’為熒光素，3’為淬滅劑5’熒光素3’淬滅劑與目標序列互補Opticon實時熒光定量PCR儀之第二十頁，共二十七頁，2022年，8月28日TaqMan工作原理Opticon實時熒光定量PCR儀之退火:無熒光信號3’3’5’5’模板和探針雜交第二十一頁，共二十七頁，2022年，8月28日延伸:聚合反應5’5’3’3’TaqMan工作原理Opticon實時熒光定量PCR儀之第二十二頁，共二十七頁，2022年，8月28日3’3’5’5’延伸:Taq酶切下5’端熒光素出現熒光TaqMan工作原理Opticon實時熒光定量PCR儀之第二十三頁，共二十七頁，2022年，8月28日TaqManSNP分析TACCGGGGGTTACGAACGGTAATGA

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CCOpticon實時熒光定量PCR儀之第二十四頁，共二十七頁，2022年，8月28日TaqMan應用范圍定量起始模板濃度基因型分析產物鑒定SNP分析Opticon實時熒光定量PCR儀之第二十五頁，共二十七頁，2022年，8月28日TaqMan優(yōu)點對目標序列有很高的特異性

---特別適合于SNP檢測與MolecularBeacons相比設計相對簡單Opticon實時熒光定量PCR儀之第二十六頁，共二十七頁，2022年，8月28日兼容化學試劑總結結合于雙鏈DNA的小溝中發(fā)夾型雜交探針水解型雜交探針