實(shí)驗(yàn)細(xì)胞化學(xué)染色POX第一頁，共七十頁，2022年，8月28日細(xì)胞化學(xué)染色，是一種以形態(tài)為基礎(chǔ)，結(jié)合運(yùn)用化學(xué)或生物化學(xué)技術(shù)對(duì)血細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)成分作定位、定性及半定量分析的方法。用于研究血細(xì)胞生理、病理和化學(xué)結(jié)構(gòu)；臨床上為某些血液病的診斷、鑒別診斷、療效觀察、預(yù)后監(jiān)測和發(fā)病機(jī)制的探討，提供重要依據(jù)。第二頁，共七十頁，2022年，8月28日血細(xì)胞化學(xué)染色的基本要求是在原位顯示細(xì)胞成分和結(jié)構(gòu)，反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)是有色沉淀物，具有一定的穩(wěn)定性。血細(xì)胞化學(xué)染色可顯示糖原、脂類、酶、蛋白質(zhì)等。第三頁，共七十頁，2022年，8月28日（一）固定固定有物理法與化學(xué)法，物理法為干燥和火焰固定，化學(xué)法最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。血細(xì)胞化學(xué)染色流程第四頁，共七十頁，2022年，8月28日（二）顯示

1、偶氮偶聯(lián)法：利用人工合成的酶底物，在酶作用下，產(chǎn)生分解產(chǎn)物，再與重氮鹽結(jié)合引起偶氮偶聯(lián)，使其形成不溶性的偶氮色素，以此證明酶的存在。

2、聯(lián)苯胺法：粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中的過氧化物酶作用于過氧化氫，釋放新生態(tài)氧，使無色的聯(lián)苯胺形成藍(lán)色沉淀。第五頁，共七十頁，2022年，8月28日3、普魯士藍(lán)法：細(xì)胞內(nèi)、外鐵與酸性亞鐵氰化鉀作用，形成藍(lán)色亞鐵氰化鐵沉淀。4、雪夫反應(yīng)：過碘酸氧化細(xì)胞內(nèi)糖類中乙二醇基形成乙醛基，醛基與雪夫試劑作用，使無色品紅形成紅色沉淀。5、金屬沉著法其他尚有物理學(xué)方法，如脂溶性染料染色（顯示脂質(zhì)）、熒光顯示、放射自顯影以及體外活體染色亦常用于臨床血液細(xì)胞學(xué)診斷。第六頁，共七十頁，2022年，8月28日（三）細(xì)胞化學(xué)定量粗略估量，以染色反應(yīng)的強(qiáng)弱，受色的深淺，人為地區(qū)別為陰性和各種程度的陽性。百分法，只能反映細(xì)胞陽性率，不能反映受色強(qiáng)弱。積分法，是常用的半定量法，將等級(jí)估量與百分率相結(jié)合它既反映了細(xì)胞陽性率的高低，又反映了細(xì)胞受色的強(qiáng)弱。第七頁，共七十頁，2022年，8月28日下面介紹幾種常用的細(xì)胞化學(xué)染色方法這些方法學(xué)在白血病的鑒別診斷上具有重要意義。第八頁，共七十頁，2022年，8月28日一、過氧化物酶染色（POX）（一）四甲基聯(lián)苯胺法(TMB)【原理】

粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的胞漿內(nèi)的髓過氧化物酶（POXorMPO）分解過氧化氫，釋放新生態(tài)氧，使無色聯(lián)苯胺氧化成藍(lán)色聯(lián)苯胺，后者進(jìn)一步變成棕色化合物沉著于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。第九頁，共七十頁，2022年，8月28日POX

新生態(tài)氧

[O]↑過氧化氫（基質(zhì)中）四甲基聯(lián)苯胺TMB（無色）聯(lián)苯胺藍(lán)（藍(lán)色）亞硝基鐵氰化鈉

藍(lán)色顆粒（漿內(nèi)酶部位）粒、單核細(xì)胞胞漿【原理】四甲基苯醌二胺(棕色)自我脫氫氧化第十頁，共七十頁，2022年，8月28日【試劑】1%TMB亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液1%過氧化氫溶液稀過氧化氫溶液瑞氏染色液第十一頁，共七十頁，2022年，8月28日

【操作】1.取0.1%TMB乙醇溶液lml，加亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液10μl，混合溶液呈淡棕黃色。2.在新鮮干燥的血片上，加混合溶液0.5ml,

放置lmin后，再加稀過氧化氫溶液0.7ml，染色6min。3.瑞氏染液復(fù)染15～20min。4.油鏡鏡檢。第十二頁，共七十頁，2022年，8月28日

【結(jié)果】細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有藍(lán)黑色顆粒者為陽性。（－）無顆粒沉著；（±）顆粒細(xì)小，分布稀疏；（+）顆粒較粗，局灶分布；（++）顆粒粗大，分布較密，占胞質(zhì)1/2~2/3；（+++）顆粒粗大，呈團(tuán)塊分布；（++++）全部胞質(zhì)均部滿顆粒，可覆蓋胞核。第十三頁，共七十頁，2022年，8月28日第十四頁，共七十頁，2022年，8月28日骨髓片POX染色第十五頁，共七十頁，2022年，8月28日【臨床意義】（1）粒系：POX主要分布在粒細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)，隨著粒細(xì)胞成熟的程度而逐漸增強(qiáng)，中性分葉核粒細(xì)胞為強(qiáng)陽性。嗜酸性粒細(xì)胞陽性程度最強(qiáng)，其陽性顆粒比中性粒細(xì)胞粗大，有折光。堿性粒細(xì)胞為陰性。第十六頁，共七十頁，2022年，8月28日（2）單核細(xì)胞：

原始單核細(xì)胞為陰性反應(yīng)，

幼稚單核細(xì)胞和成熟單核細(xì)胞呈弱陽性反應(yīng)，顆粒細(xì)小，彌散分布。第十七頁，共七十頁，2022年，8月28日（3）其他細(xì)胞淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、幼紅細(xì)胞、組織細(xì)胞、巨核細(xì)胞均呈陰性反應(yīng)。（4）血小板過氧化物酶主要定位于幼稚型巨核細(xì)胞的核膜上，可作為原巨核細(xì)胞的一種標(biāo)志物，有助于FABM7的識(shí)別。第十八頁，共七十頁，2022年，8月28日（5）過氧化物酶染色主要用于鑒別急性白血病類型，急性髓細(xì)胞白血病多呈陽性反應(yīng)，以M3和M2型反應(yīng)最強(qiáng)，MI和M5型反應(yīng)較弱，故有助于區(qū)別M3和M5型。急性淋巴細(xì)胞白血病呈POX陰性反應(yīng)，故為急性髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞白血病鑒別的重要指標(biāo)。第十九頁，共七十頁，2022年，8月28日

注意事項(xiàng)

涂片應(yīng)新鮮制作、厚薄適宜。TMB配制在85％～88％的乙醇溶液中染色效果較好，勿用90％～95％乙醇，否則細(xì)胞表面蛋白質(zhì)很快凝固，妨礙試劑向胞內(nèi)滲入而使顯色反應(yīng)減弱或消失。過氧化氫溶液需新鮮配制，其濃度與加入量不能隨意更改。涂片中粒細(xì)胞看不見陽性顆粒，紅細(xì)胞呈棕色或綠色，即表示過氧化氫過濃。若過氧化氫加于血片上不產(chǎn)生氣泡，則示無效。染色液適宜pH值應(yīng)為5.5，若pH值<5.0會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。試劑應(yīng)置于低溫暗處，防止光線照射失效。染色時(shí)加稀過氧化氫溶液之后必須與染色液充分混勻，否則同一片子上細(xì)胞染色情況不一致。第二十頁，共七十頁，2022年，8月28日AML-M1第二十一頁，共七十頁，2022年，8月28日第二十二頁，共七十頁，2022年，8月28日M1-POX(+)第二十三頁，共七十頁，2022年，8月28日×第二十四頁，共七十頁，2022年，8月28日二、蘇丹黑B染色【原理】蘇丹黑B(sudanblackB,SB)是一種能溶解于脂肪中的色素染料，可使細(xì)胞內(nèi)的中性脂肪、磷脂和類固醇著色，即使細(xì)胞內(nèi)微細(xì)結(jié)構(gòu)的脂類物質(zhì)也能顯示出來。第二十五頁，共七十頁，2022年，8月28日【試劑】1.10%甲醛液。2.蘇丹黑B乙醇溶液第二十六頁，共七十頁，2022年，8月28日【操作】1．干燥血片或骨髓片在甲醛蒸氣中固定。2．自來水沖洗。3．放人染色液中，37℃染色30~60min。4．用70%乙醇脫色1~2min，水洗lmin。.5．瑞氏染液復(fù)染20~30min。第二十七頁，共七十頁，2022年，8月28日

【結(jié)果】脂類呈黑色或棕黑色顆粒，定位于細(xì)胞漿中（+）顆粒很小，細(xì)小、稀疏，或胞質(zhì)局部面積的1/4有致密的顆粒。（++）顆粒較少，或胞質(zhì)面積的1/2出現(xiàn)黑色顆粒。（+++）顆粒較密，或胞質(zhì)面積的3/4出現(xiàn)黑色顆粒。（++++）顆粒極密，顆粒間無間隙。第二十八頁，共七十頁，2022年，8月28日【臨床意義】1.粒細(xì)胞系早幼粒及以下階段隨著細(xì)胞成熟，陽性顆粒逐漸增加。早期原粒細(xì)胞一般為陰性，少數(shù)細(xì)小點(diǎn)狀顆粒代表線粒體被染色晚期原粒細(xì)胞可出現(xiàn)陽性顆粒，其顆粒限于胞漿的某一區(qū)域。第二十九頁，共七十頁，2022年，8月28日2.單核細(xì)胞系陽性，顆粒細(xì)小，分布彌散，形狀不規(guī)則。原單核細(xì)胞為陰性。3．紅細(xì)胞系、淋巴細(xì)胞系均呈陰性反應(yīng)4．尼曼一匹克細(xì)胞和戈謝細(xì)胞均為陽性反應(yīng)。第三十頁，共七十頁，2022年，8月28日5．蘇丹黑B和過氧化物酶染色臨床意義相似，主要用于急性白血病類型的鑒別。蘇丹黑B染色較過氧化物酶染色更敏感，但特異性不如過氧化物酶染色（極少數(shù)急性淋巴細(xì)胞白血病可為陽性）。第三十一頁，共七十頁，2022年，8月28日M1-SBB(+)第三十二頁，共七十頁，2022年，8月28日M2-SBB(+)第三十三頁，共七十頁，2022年，8月28日三、過碘酸一雪夫（PAS)染色【原理】

胞漿內(nèi)存在糖原或多糖類物質(zhì)（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）經(jīng)過碘酸（periodicacid）氧化，轉(zhuǎn)變?yōu)槎┗–HO-CHO），與雪夫(Schiff)試劑中的無色品紅結(jié)合，形成紫紅色染料而沉積于胞漿中。該反應(yīng)稱為過碘酸一雪夫(PAS)陽性反應(yīng)。第三十四頁，共七十頁，2022年，8月28日【結(jié)果】（1）粒細(xì)胞系：原粒細(xì)胞多呈陰性反應(yīng)，也可弱陽性。自早幼粒細(xì)胞以后隨著細(xì)胞的成熟程度，陽性反應(yīng)逐漸增強(qiáng)。嗜酸粒細(xì)胞顆粒本身不著色，但顆粒間的胞質(zhì)呈彌漫性陽性反應(yīng)；嗜堿粒細(xì)胞為陽性反應(yīng)，顆粒紫紅色，大小不一。第三十五頁，共七十頁，2022年，8月28日

中性粒細(xì)胞糖原含量參考標(biāo)準(zhǔn)（-）胞質(zhì)無顆粒（+）胞質(zhì)呈淡紅色，無顆粒（++）胞質(zhì)呈紅色，有少量顆粒（+++）胞質(zhì)呈暗紅色，顆粒較密（++++）胞質(zhì)呈紫紅色，顆粒極密第三十六頁，共七十頁，2022年，8月28日過碘酸-Schiff反應(yīng)(PAS)第三十七頁，共七十頁，2022年，8月28日（2）淋巴細(xì)胞系：

大多數(shù)淋巴細(xì)胞呈陰性反應(yīng)，

少數(shù)為（+）的陽性反應(yīng)。淋巴細(xì)胞糖原含量程度參考標(biāo)準(zhǔn)（-）胞質(zhì)內(nèi)無顆粒（+）胞質(zhì)內(nèi)有顆粒（++）有較粗紅色顆粒（+++）有粗大紅色顆粒（++++）顆粒粗大并有紅色塊狀第三十八頁，共七十頁，2022年，8月28日

（3）紅細(xì)胞系：

幼紅細(xì)胞和紅細(xì)胞呈陰性反應(yīng)紅細(xì)胞系列糖原含量程度參考標(biāo)準(zhǔn)（-）胞質(zhì)無顆粒（+）有少數(shù)紅色顆粒（++）有較粗紅色顆粒或彌漫紅色（+++）有粗大紅色顆?；蛏罴t色（++++）有粗大紅色塊狀或紫紅色第三十九頁，共七十頁，2022年，8月28日（4）巨核細(xì)胞：

巨核細(xì)胞和血小板染色反應(yīng)均為陽性巨核細(xì)胞糖原含量程度參考標(biāo)準(zhǔn)（-）胞質(zhì)無顆粒（+）少量糖原包涵體（++）中等量糖原包涵體，定位于核膜出或分散胞質(zhì)中，占胞質(zhì)1/3

（+++）大量糖原包涵體分散于胞質(zhì)的1/2

（++++）糖原包涵體充滿整個(gè)胞質(zhì)第四十頁，共七十頁，2022年，8月28日PAS巨核細(xì)胞巨核細(xì)胞包涵體第四十一頁，共七十頁，2022年，8月28日

（5）單核細(xì)胞呈陰性或陽性，顆粒細(xì)小，往往位于胞質(zhì)邊緣；

漿細(xì)胞大多呈陰性，少數(shù)為紅色顆粒陽性；

組織細(xì)胞為陰性反應(yīng)；巨噬細(xì)胞可呈陽性，為紅色顆粒反應(yīng)。第四十二頁，共七十頁，2022年，8月28日

【臨床意義】（1）M6與巨幼貧的鑒別

M6的幼紅細(xì)胞PAS可呈強(qiáng)陽性，積分明顯增高，巨貧、再障、溶貧時(shí)PAS反應(yīng)為陰性。（2）急性白血病的類型鑒別

ALL，PAS呈大塊狀陽性，也可是陰性，AML為陰性，急性單核細(xì)胞白血病時(shí)原單核細(xì)胞及幼單核細(xì)胞PAS陽性，積分增高，陽性顆粒小而多，呈彌散分布。第四十三頁，共七十頁，2022年，8月28日ALL-L1第四十四頁，共七十頁，2022年，8月28日L1PAS(+)第四十五頁，共七十頁，2022年，8月28日AML-M5第四十六頁，共七十頁，2022年，8月28日M5PAS(+)第四十七頁，共七十頁，2022年，8月28日AML-M6第四十八頁，共七十頁，2022年，8月28日AML-M6PAS(+)第四十九頁，共七十頁，2022年，8月28日AML-M7第五十頁，共七十頁，2022年，8月28日M7PAS(+)第五十一頁，共七十頁，2022年，8月28日（3）巨核細(xì)胞和Sternberg細(xì)胞鑒別

巨核細(xì)胞PAS強(qiáng)陽性，Sternberg細(xì)胞為陰性或弱陽性。（4）戈謝氏細(xì)胞強(qiáng)陽性，尼曼-皮克細(xì)胞陰性或弱陽性。（5）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴細(xì)胞的糖原積分增高；一般的病毒感染，糖原積分在正常范圍內(nèi)。第五十二頁，共七十頁，2022年，8月28日四、中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色偶氮偶聯(lián)法（Kaplow法）【原理】中性粒細(xì)胞胞漿中的堿性磷酸酶在pH9.2~9.8緩沖液中，能水解磷酸萘酚鈉，并釋放出磷酸與萘酚。再以重氮鹽與萘酚偶聯(lián)成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞漿中。第五十三頁，共七十頁，2022年，8月28日【結(jié)果】堅(jiān)牢藍(lán)RR陽性為紫黑色顆粒，堅(jiān)牢紫醬GBC陽性為棕紅色沉淀?！耙弧标幮苑磻?yīng)，胞漿中無陽性染色顆粒?！埃卑麧{中含有少量顆粒或呈彌散淺紅色（或彌散紫色）。

“2＋”胞漿中含有中等量顆?；驈浬⑹苌??！?＋”胞漿中有豐富的顆粒或彌散深色，胞核清晰?！?＋”有極豐富的粗大顆粒，充滿胞漿，或彌散深色，胞核不清晰。第五十四頁，共七十頁，2022年，8月28日中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶(NAP)偶氮偶聯(lián)法第五十五頁，共七十頁，2022年，8月28日

NAP積分法

計(jì)數(shù)100個(gè)成熟中性粒細(xì)胞，按其反應(yīng)強(qiáng)度分級(jí)，各級(jí)百分率與其級(jí)數(shù)乘積的總和，即為積分。例如：NAP反應(yīng)結(jié)果（%）（-）（+）（++）（+++）（++++）

204020155

積分=（0×20）+（2×20）+（3×15）+（4×5）=145

參考值：正常人血細(xì)胞堿性磷酸酶除成熟中性粒細(xì)胞（桿狀核及分葉核）可見陽性外，其他血細(xì)胞均為陰性。中性粒細(xì)胞NAP活性積分值一般為10～50分，但有時(shí)可高達(dá)162分。

第五十六頁，共七十頁，2022年，8月28日

【臨床意義】（1）生理變化：

新生兒NAP增高，成人較兒童減低，老人更低；激烈運(yùn)動(dòng)增高；

月經(jīng)期經(jīng)前增高，行經(jīng)后降低，經(jīng)后期恢復(fù)正常；

妊娠期2-3月輕度增高，以后逐漸增高，分娩時(shí)達(dá)到高峰，產(chǎn)后恢復(fù)正常。第五十七頁，共七十頁，2022年，8月28日（2）、病理變化

增高：嚴(yán)重化膿性感染、類白血病反應(yīng)、AA、CML加速期、ALL、CLL、惡性淋巴瘤、癌轉(zhuǎn)移、MM、真紅、骨髓纖維化等。

減低：PNH、CML、惡性組織細(xì)胞病、MDS。第五十八頁，共七十頁，2022年，8月28日

（3）疾病鑒別診斷慢粒與類白的鑒別：CML減低，類白增高。急性白血病的鑒別：AML減低，ALL增高。

PNH與AA鑒別：PNH減低，AA增高。病原微生物的鑒別：病毒感染減低，細(xì)菌感染增高。第五十九頁，共七十頁，2022年，8月28日第六十頁，共七十頁，2022年，8月28日NAP(++++)CML-NAP(-)第六十一頁，共七十頁，2022年，8月28日五、骨髓鐵染色

【原理】正常人骨髓中的貯存鐵主要存在于骨髓小粒和幼紅細(xì)胞中，骨髓中的鐵在酸性環(huán)境下與亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍(lán)反應(yīng)，形成藍(lán)色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵的部位，從而反映骨髓中鐵的儲(chǔ)存量?；瘜W(xué)反應(yīng)過程為：

4Fe3+＋3K4［Fe（CN）6］→Fe4〔Fe（CN）6〕3＋12K+（含鐵物質(zhì)）

（亞鐵氰化鉀）

（亞鐵氰化鐵）

第六十二頁，共七十頁，2022年，8月28日【結(jié)果】

（1）細(xì)胞外鐵的觀察：

細(xì)胞外鐵呈藍(lán)色的顆粒狀、小株?duì)罨驁F(tuán)塊狀。以油鏡觀察定級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（-）無鐵?？梢?。（+）少數(shù)鐵?；蜩F小珠。