第七章

酶的發(fā)酵生產第一節(jié)酶的生產方式第二節(jié)產酶工藝條件及其調節(jié)控制第三節(jié)微生物發(fā)酵產酶第四節(jié)植物細胞物發(fā)酵產酶第五節(jié)動物細胞發(fā)酵產酶酶的生產是指通過各種方法獲得人們所需酶的技術過程。酶的生產是酶工程的首要任務，只有通過生產獲得酶以后，才有可能進一步進行各項酶學研究，也才有可能進行酶的改性和酶的應用等。提取分離法：傳統(tǒng)方法酶的生產生物合成法：20世紀50年代以來主要方法化學合成法：實驗室階段經過預先設計，通過人工操作，利用微生物細胞、植物細胞或動物細胞的生命活動而獲得人們所需酶的技術過程稱為生物合成法。一、生產流程：首先要經過篩選、誘變、細胞融合、基因重組等方法獲得優(yōu)良的產酶細胞，然后在人工控制條件的生物反應器中進行細胞培養(yǎng)，通過細胞內物質的新陳代謝作用，生成所需的酶和各種代謝產物，再經過分離純化得到所需的酶。酶發(fā)酵生產的一般工藝流程

二、方法根據(jù)所使用細胞種類的不同：經過預先設計，通過人工操作，利用微生物細胞的生命活動合成所需酶的生產方法稱為酶的發(fā)酵法生產。根據(jù)微生物細胞培養(yǎng)方式的不同，可分為液體深層培養(yǎng)發(fā)酵、固體培養(yǎng)發(fā)酵、固定化細胞發(fā)酵、固定化原生質體發(fā)酵等。微生物發(fā)酵產酶植物細胞培養(yǎng)產酶動物細胞培養(yǎng)產酶生物合成法動、植物細胞培養(yǎng)產酶，也應先獲得優(yōu)良的產酶細胞，然后在人工控制條件的生物反應器中培養(yǎng)，經過細胞的生命活動合成酶，再經分離純化得到所需的酶。三、特點生物合成法與提取分離法比較，具有生產周期較短，酶的產率較高，不受生物資源、地理環(huán)境和氣候條件的影響等顯著特點。生物合成法對發(fā)酵設備和工藝條件的要求較高，在生產過程中必須進行嚴格的控制。第一節(jié)酶的生產方式酶在細胞內合成的過程稱為酶的生物合成。在酶的生產過程中，首先要選擇優(yōu)良的產酶細胞，再在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在一定的條件下通過細胞的生命活動進行酶的生物合成，然后經過分離得到所需要的酶。一、細胞的選擇雖然所有的生物體細胞在一定條件下都能合成多種多樣的酶，但是在酶的生產中使用的細胞必須根據(jù)需要進行嚴格的選擇與培育。須具備以下條件：選擇條件⑴酶的產量高⑵容易培養(yǎng)和管理⑶產酶穩(wěn)定性好⑷利于酶的分享純化⑸安全可靠，無毒性1、微生物產酶的微生物包括細菌、放線菌、霉菌、酵母等。已廣泛運用于酶的發(fā)酵生產中。常用的產酶微生物：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌、黑曲霉、米曲霉、青霉菌、木霉、根霉、毛霉、紅曲霉、啤酒酵母、假絲酵母等。2、植物細胞主要用于色素、藥物、香精、酶等次級代謝物生產。常用的產酶植物細胞有：見教材。3、動物細胞主要用于疫苗、抗體、激素、多肽、酶等功能蛋白質的生產。動物細胞模式圖植物細胞結構細胞種類植物細胞微生物細胞動物細胞細胞大小/um200～3001～1010～100倍增時間/h﹥120.3-6﹥15營養(yǎng)要求簡單簡單復雜光照要求大多數(shù)要求不要求不要求對剪切力敏感大多數(shù)不敏感非常敏感主要產物色素、藥物、香精、酶等醇、有機酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、單克隆抗體、酶等植物、動物、微生物細胞的特性比較二、培養(yǎng)基的配制在設計和配制培養(yǎng)基時，首先要根據(jù)不同細胞和不同用途的不同要求，確定各種組分的種類和含量，并調節(jié)好pH值，以滿足細胞生長、繁殖和新陳代謝的需要。不同的細胞對培養(yǎng)基的要求不同；同一種細胞用于生產不同物質時，所要求的培養(yǎng)基有所不同；甚至在不同的生理階段，對培養(yǎng)基的要求也有所不同。必須根據(jù)細胞的需要配置不同的培養(yǎng)基。1、培養(yǎng)基的基本組分⑴碳源既是營養(yǎng)物質也是能源物質。選擇要求：①符合細胞營養(yǎng)要求和代謝調節(jié)的需要。大多數(shù)產酶微生物采用淀粉或其水解產物；植物細胞通常以蔗糖為碳源；動物細胞則以谷氨酰胺或谷氨酸為碳源。②來源充分、價格低廉、有利于發(fā)酵工藝條件并容易使酶分離純化。某些碳源物質對酶生物合成具有代謝調節(jié)的功能。⑵氮源氮源是細胞生長、繁殖的重要營養(yǎng)物質，也是酶分子的主要組成元素。氮源可分為有機氮源和無機氮源。有機氮源主要是各種蛋白質及其水解產物；無機氮源是各種含氮的無機化合物。①選擇要求：動物細胞要求氨基酸、蛋白胨等有機氮源；植物細胞主要使用銨鹽、硝酸鹽等無機氮源；微生物細胞中，異養(yǎng)型細胞要求有機氮源，自養(yǎng)型細胞可以采用無機氮源，一般微生物采用混合氮源。②注意事項A)使用無機氮源時，銨鹽和硝酸鹽的比例對細胞的生長和新陳代謝有顯著影響；B)碳氮比（C/N）對酶的產量有顯著影響。⑶礦物質提供細胞生命活動所需的各種無機元素，并對細胞內外的pH、氧化還原電位和滲透壓起調節(jié)作用。根據(jù)需要量可分為大量元素和微量元素。大量元素主要指P、S、K、Na、Ca、Mg、Cl等；微量元素主要指Cu、Mn、Zn、Mo、Co、Br、I等。微量元素的需要量應嚴格控制，過量反而會影響細胞的生命活動。礦物質通過在培養(yǎng)基中添加無機鹽提供。一般采用添加水溶性的硫酸鹽、磷酸鹽、鹽酸鹽或硝酸鹽。⑷生長因子指細胞生長、繁殖所必須的微量有機化合物。主要包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素、生長激素等。嘌呤、嘧啶是某些輔酶或輔基的成分；維生素是輔酶的成分；動植物生長因素對細胞的生長、分裂具有調節(jié)作用。三、微生物培養(yǎng)基用于微生物培養(yǎng)和發(fā)酵生產的各種培養(yǎng)基的總稱。不同的微生物生產不同的酶，所使用的培養(yǎng)基成分不同。在微生物培養(yǎng)基中，碳源一般采用淀粉或其水解產物，氮源一般采用同時含有有機氮源和無機氮源的混合氮源，礦物質和生長因子則根據(jù)微生物生長的需要進行添加。四、植物細胞培養(yǎng)基用于植物細胞培養(yǎng)和生產各種產物的培養(yǎng)基。1、植物細胞培養(yǎng)基的特點⑴生長和代謝需要大量礦物質。培養(yǎng)液中大量元素的濃度一般為102~3×103mg/L（P41B3-2），微量元素的濃度一般為10-2×30mg/L（P42B3-3）⑵需要多種生長因子（維生素和生長激素）。如VB1、VB6、煙酸、肌醇、生長素、分裂素等。培養(yǎng)液中維生素的濃度一般為0.1~100mg/L（P42B3-6），植物生長激素的濃度一般為0.1~10mg/L。⑶氮源一般要求為無機氮源。⑷碳源一般為蔗糖，濃度為2%~5%。2、常見植物細胞培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、KM-8P培養(yǎng)基。（見教材）3、植物細胞培養(yǎng)基的配置通常將各種組分分成大量元素液、微量元素液、維生素溶液和植物激素溶液等幾大類（10倍或100倍母液，置于冰箱保存）。使用時，將母液按配方比例混合、稀釋后加入培養(yǎng)基。五、動物細胞培養(yǎng)基用于動物細胞培養(yǎng)和生產各種產物的培養(yǎng)基。1、動物細胞的組分⑴氨基酸：必須加入8種必須氨基酸（賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸）以及半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺等。⑵維生素：在血清含量低或無的培養(yǎng)基中須補充B族維生素，有的還須補充Vc。⑶礦物質：必須添加含有大量元素的無機鹽類，如Na+、K+、Ca2+、Mg2+、PO33-、SO42-、Cl-、HCO3-等用于調節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓。微量元素可由血清提供，在無血清的培養(yǎng)基中，需要添加Fe、Cu、Zn、Se等。⑷葡萄糖：葡萄糖含量較高的培養(yǎng)基中容易產生乳酸。研究表明，在動物細胞培養(yǎng)基中，細胞所需的能量和碳素來自谷氨酰胺。⑸激素：培養(yǎng)過程中需要胰島素、生長激素等。動物細胞所需的激素一般在血清中已存在，在無血清或低血清的培養(yǎng)基中須添加適量的激素。⑹生長因子：血清中含有的各種生長因子能夠滿足動物細胞生長繁殖的需要。在無血清或低血清的培養(yǎng)基中，需要添加適量的表皮生長因子、神經生長因子、成纖維細胞生長因子等。第二節(jié)產酶工藝條件及其調節(jié)控制在酶的生產過程中，除了選擇性能優(yōu)良的產酶細胞和配置適宜的培養(yǎng)基以外，還必須進行產酶工藝條件的優(yōu)化控制，以滿足細胞生長、繁殖和產酶的需要。保藏細胞細胞活化細胞擴大培養(yǎng)分離純化酶固定化細胞預培養(yǎng)產酶無菌空氣原生質體固定化原生質體培養(yǎng)基酶生產工藝流程一、細胞活化與擴大培養(yǎng)為了保持細胞的生長、繁殖和遺傳特性，可通過各種保藏方法進行細胞的貯藏。1、細胞活化在細胞應用過程中，保藏的細胞須先接種于新鮮培養(yǎng)基上，在一定的條件下進行培養(yǎng)，使細胞的生命活性得以恢復，此過程稱為細胞活化。2、擴大培養(yǎng)經活化的細胞在種子培養(yǎng)基中經過一級乃至數(shù)級的擴大培養(yǎng)，以獲得足夠數(shù)量優(yōu)質細胞的過程。⑴培養(yǎng)基的成分：種子擴大培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基一般應含有較為豐富的氮源，碳源可相對少一點。⑵培養(yǎng)條件：溫度、pH、溶解氧等條件，應盡量滿足細胞生長和繁殖的需要。培養(yǎng)時間一般以培養(yǎng)到細胞對數(shù)生長期為宜。接種量一般為培養(yǎng)基總量的1%~10%。二、pH的調節(jié)控制培養(yǎng)基的pH值與細胞的生長繁殖以及產酶關系密切。除在起始培養(yǎng)基應調節(jié)到適宜的pH，在產酶過程中必須根據(jù)變化的情況進行必要的調節(jié)控制。1、生長最適pH：不同的細胞，其生長繁殖的最適pH不同。細菌或放線菌：中性或偏弱堿性，pH=6.5~8霉菌和酵母：偏酸性，pH=4~6植物細胞：偏酸性，pH=5.2~5.8動物細胞：中性，pH=7.2~7.62、細胞產酶最適pH：細胞產酶最適pH通常接近于該酶催化反應的最適pH。如生產堿性、中性、酸性蛋白酶時的pH。但個別酶在其催化反應的最適條件下，產酶細胞的生長和代謝可能受到影響，其細胞產酶最適pH與酶催化反應的最適pH有所差別。如枯草桿菌堿性磷酸酶。有些細胞可同時產生若干種酶，通過控制培養(yǎng)的pH，可以控制各種酶之間的產量比例。3、調節(jié)控制最適pH的方法隨著細胞的生長繁殖和新陳代謝產物的積累，培養(yǎng)基的pH往往會發(fā)生變化。這與細胞的特性、培養(yǎng)培養(yǎng)基的成分或生產工藝條件相關，在產酶過程中可根據(jù)需要對培養(yǎng)基的pH進行適當?shù)恼{節(jié)。調節(jié)方法有：⑴改變培養(yǎng)基的組分或其比例；⑵使用緩沖液穩(wěn)定pH；⑶加入適量的稀酸、稀堿溶液調節(jié)pH。三、溫度的調節(jié)的控制產酶細胞只有在一定的溫度范圍內才能正常生長、繁殖和維持正常新陳代謝。不同的細胞有各自不同的最適生長溫度。但有些細胞產酶的最適溫度與細胞生長的最適生長溫度有所不同，一般會低于生長最適溫度。這是由于在較低的溫度條件下，可以提高酶所對應的mRNA的穩(wěn)定性，增加酶生物合成的延續(xù)時間，從而提高酶的產量。生產中須進行最適實驗，以確定最適產酶溫度。細胞在生長和產酶的過程中，由于新陳代謝作用，會不斷放出熱量，致使培養(yǎng)基的溫度升高，同時由于培養(yǎng)基中的熱量的不斷擴散，培養(yǎng)基溫度下降。兩者綜合的結果，決定了培養(yǎng)基的溫度。在細胞生長和產酶的不同階段，細胞釋放的熱量有較大差異；而熱量的散失，受到環(huán)境溫度等因素的影響。因此，應對培養(yǎng)基的溫度進行調節(jié)控制，使培養(yǎng)基維持在適宜的溫度范圍內。調節(jié)控制的方法一般采用熱水升溫、冷水降溫的方法。一般生物反應器均有各種熱交換裝置。四、溶解氧的調節(jié)控制指溶解在培養(yǎng)基（液體）中的氧氣。一般情況下培養(yǎng)基的溶解氧較少。但培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞主要吸收和利用溶解氧，在培養(yǎng)過程中溶解氧將很快被消耗完，致使細胞培養(yǎng)受阻。在生產過程中須不斷供給氧（無菌空氣），使培養(yǎng)基中的的溶解氧保持在一定的水平。1、溶解氧的調節(jié)控制理論：主要根據(jù)細胞對溶解氧的需要量，連續(xù)不斷的進行補充，使培養(yǎng)基中的溶解量的保持在一定水平。式中：KO2——耗氧速率，mmol氧/(h.L)QO2——細胞呼吸強度，mmol氧/(h.g干細胞)或mmol氧/(h.每個細胞)Cc——細胞濃度，g干細胞/L細胞對溶解氧的需要量與細胞的呼吸強度及培養(yǎng)基中的細胞濃度密切相關。在酶的生產過程中，處于不同生長階段的細胞，其細胞濃度和細胞呼吸強度各不相同，致使耗氧速率有很大的差別。因此，必須根據(jù)耗氧量的不同，不斷供給適量的溶解氧。2、溶解氧的供給一般將無菌空氣通入發(fā)酵容器，在一定條件下使空氣中的氧溶解到培養(yǎng)液中，以供細胞生命活動的需要。培養(yǎng)液中溶解氧的量，決定于在一定條件下氧氣的溶解速度（溶氧速率或溶氧系數(shù)）。溶氧速率指單位體積的發(fā)酵液在單位時間內所溶解的氧的量，用Kd表示，單位為mmol氧/(h.L)。溶氧速率與通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時間、氣液接觸面積以及培養(yǎng)液的性質有密切關系。一般通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時間、氣液接觸面積與溶氧速率成正比。另外培養(yǎng)液的性質，主要是黏度、氣泡以及溫度對溶氧速率也有明顯影響。當KO2=Kd，培養(yǎng)液中的溶解氧的量保持恒定，可以滿足細胞生長和發(fā)酵產酶的需要。3、調節(jié)溶解氧的主要方法當細胞耗氧速度發(fā)生改變時，必須相應對溶氧速率進行調節(jié)。⑴調節(jié)通氣量⑸改變培養(yǎng)液的性質⑶調節(jié)氣液接觸時間⑵調節(jié)氧的分壓⑷調節(jié)氣液接觸面積第三節(jié)微生物發(fā)酵產酶一、微生物發(fā)酵產酶的方式及其特點酶的發(fā)酵生產根據(jù)微生物培養(yǎng)方式的不同，分為：固體培養(yǎng)發(fā)酵液體深層發(fā)酵固定化細胞發(fā)酵固定化原生質體發(fā)酵1、固體培養(yǎng)發(fā)酵在固體或者半固體培養(yǎng)基中接種微生物，在一定條件下進行發(fā)酵，以獲得所需酶的發(fā)酵方法。⑴主要目的：獲得淀粉酶類和蛋白酶類，用于催化淀粉的蛋白質的水解。⑵工藝特點：設備簡單、操作方便、麩曲中酶的濃度較高，特別適應于各種霉菌的培養(yǎng)和產酶。但勞動強度大，原料利用率低，生產周期長。⑵液體深層發(fā)酵在液體培養(yǎng)基中接種微生物，在一定條件下進行發(fā)酵，生產得到所需酶的發(fā)酵方法。適合于微生物細胞的發(fā)酵生產，也可用于動、植物細胞的培養(yǎng)。是目前酶發(fā)酵生產的主要方式。工藝特點：機械化程度較高，技術管理較嚴格，酶的產率較高，質量較穩(wěn)定，產品回收率較高。⑶固定化細胞發(fā)酵是在固定化酶的基礎上發(fā)展起來的發(fā)酵技術。固定化細胞是指在固定在水不溶性的載體上，在一定的空間范圍內進行生命活動的細胞。工藝特點：細胞密度大，產酶能力高；發(fā)酵穩(wěn)定性好，可反復或連續(xù)使用；細胞固定在載體上，流失較少，可以在高稀釋率的條件下連續(xù)發(fā)酵，利于自動化生產，并有利于酶的分離純化。⑷固定化原生質體發(fā)酵指在固定在載體上，在一定的空間范圍內進行生命活動的原生質體。固定化原生質沒有細胞壁的屏障，有利于胞內物質透過細胞膜擴散到胞外，從而可不經過細胞破碎和提取工藝直接從發(fā)酵液中分離得到所需的酶。固定化原生質體發(fā)酵為胞內酶等胞內物質的工業(yè)化生產開辟了新途徑。二、提高酶產量的措施酶的生產過程中，在選擇使用優(yōu)良的產酶細胞，進行發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化控制之外，所采取的措施。添加誘導物控制阻礙物的濃度添加表面活性劑添加產酶促進劑1、添加誘導物誘導物是能夠使某些酶的生物合成開始或者加速進行的物質。在誘導酶的發(fā)酵過程中，添加適當?shù)恼T導物，在一定的條件下，就可以加速酶的生物合成，提高酶的產量。一般來說，不同的酶有不同的誘導物；同一種酶往往有多種誘導物。誘導物一般分三類：酶的作用底物、酶的催化反應產物和作用底物的類似物。2、控制阻礙物的濃度指能夠引起某些酶的生物合成停止或減速進行的物質。阻遏作用根據(jù)作用機理的不同分為以下二種：產物阻遏除去終產物添加阻止產物形成的抑制劑分解代謝物阻遏避免使用葡萄糖避免培養(yǎng)基過于豐富添加一定量的cAMP3、添加表面活性劑細胞膜具有選擇透性，用于控制胞外物質的吸收和胞內物質的分泌。在培養(yǎng)基中添加表面活性劑，能夠與細胞膜相互作用，增加細胞的透過性，有利于胞外酶的分泌，提高酶的產量。表面活性劑離子型對細胞有毒害作用非離子型Tween－80TritonX－100增加細胞通透性4、添加產酶促進劑指可以促進產酶，但是作用機理尚未闡明清楚的物質。但其能夠提高酶的產量。三、酶發(fā)酵動力學發(fā)酵動力學是研究發(fā)酵過程中，細胞生長速度、產物生成速度、基質消耗速度以及環(huán)境因素對速度的影響的學科。在酶的生產過程中，研究細胞生長的動力學和產酶動力學，對于了解本科的生物合成模式、發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化控制、提高酶的產率等方面均具有重要意義。(一)酶生物合成的模式在分批培養(yǎng)(batchculture)過程中，細胞生長一般要經歷調整期（延遲期）、指數(shù)生長期、平穩(wěn)期和衰亡期四個階段。時間/h細胞濃度/(mg/mL)OACDB

細胞生長曲線

O-A調整期A-B指數(shù)生長期B-C平穩(wěn)期C-D衰亡期總細胞濃度活細胞濃度(一)酶生物合成的模式在分批培養(yǎng)(batchculture)過程中，細胞生長一般要經歷調整期、指數(shù)生長期、平穩(wěn)期和衰亡期四個階段。時間/h細胞濃度/(mg/mL)OACDB

細胞生長曲線

O-A調整期A-B指數(shù)生長期B-C平穩(wěn)期C-D衰亡期總細胞濃度活細胞濃度根據(jù)酶的合成與細胞生長之間的關系，可將酶的生物合成分為四種模式，即：

同步合成型生長偶聯(lián)型——中期合成型部分生長偶聯(lián)型——延續(xù)合成型非生長偶聯(lián)型——滯后合成型1、生長偶聯(lián)型（又稱同步合成型）酶的生物合成與細胞生長同步。特點：酶的合成可以誘導，但不受分解代謝物阻遏和反應產物阻遏。當去除誘導物、細胞進入平衡期后，酶的生物合成立即停止，表明這類酶所對應的mRNA很不穩(wěn)定。時間/h細胞濃度/(mg/mL)

枯草桿菌堿性磷酸酶生物合成曲線細胞濃度酶濃度

0268410酶濃度/(U/mL)2、生長偶聯(lián)型中的特殊形式——中期合成型酶的合成在細胞生長一段時間后才開始，而在細胞生長進入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。特點：酶的合成受產物的反饋阻遏或分解代謝物阻遏。所對應的mRNA是不穩(wěn)定的。3、部分生長偶聯(lián)型（又稱延續(xù)合成型）酶的合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長一段時間。特點：可受誘導，一般不受分解代謝物和產物阻遏。所對應的mRNA相當穩(wěn)定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線4、非生長偶聯(lián)型（又稱滯后合成型）只有當細胞生長進入平衡期以后，酶才開始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。特點：受分解代謝物的阻遏作用。所對應的mRNA穩(wěn)定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線總結：影響酶生物合成模式的主要因素1、mRNA的穩(wěn)定性高：可在細胞停止生長后繼續(xù)合成酶；差：隨著細胞停止生長而終止酶的合成。2、培養(yǎng)基中阻遏物的存在不受阻遏：隨著細胞的生長而開始酶的合成。受阻遏：細胞生長一段時間或平衡期后，酶才開始合成。酶生產中最理想的合成模式：延續(xù)合成型：發(fā)酵過程中沒有生長期和產酶期的明顯差別。細胞開始生長就有酶的產生，直至細胞生長進入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時間。同步合成型：提高對應的mRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵溫度。滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使酶的合成提早開始。中期合成型：要在提高mRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面努力。

(二)細胞生長動力學營養(yǎng)物濃度（生長限制基質濃度）和生長速率之間的動力學關系：Monod模型μ:比生長速率（1/h）（specificgrowthrate）μmax：最大比生長速率（1/h）S：營養(yǎng)物濃度（生長限制基質濃度）克/LKs：莫諾德常數(shù)或飽和常數(shù)或營養(yǎng)物利用常數(shù)

克/L，或mol/L(三)產酶動力學一般產酶動力學方程可表達為：式中：X——細胞濃度(g/L)

——細胞比生長速率(h-1)

——生長偶聯(lián)的比產酶系數(shù)(IU/g)

——非生長偶聯(lián)的比產酶速率(IU/(gh))

E——酶濃度(IU/L)

t——時間(h)生長偶聯(lián)型部分生長偶聯(lián)型

非生長偶聯(lián)型

四、固定化微生物細胞發(fā)酵產酶固定化細胞是指采用各種方法固定在載體上，在一定的空間范圍進行生長、繁殖和新陳代謝的細胞。(一)固定化細胞產酶的特點1、提高產酶率2、可以反復使用或連續(xù)使用較長時間3、穩(wěn)定性好4、縮短發(fā)酵周期，提高設備利用率5、產品容易分離純化6、適用于胞外酶等胞外產物的生產(二)固定化細胞發(fā)酵產酶的工藝條件控制與游離細胞發(fā)酵工藝條件基本相同。但其工藝條件控制需要注意以下事項：1、固定化細胞的預培養(yǎng)2、溶解氧的供給3、溫度的控制4、培養(yǎng)基組分的控制(三)固定化細胞生長和產酶動力學參照前節(jié)1、固定化細胞生長動力學2、固定化細胞產酶動力學3、固定化細胞連續(xù)產酶動力學五、固定化原生質體發(fā)酵產酶固定化原生質體是指采用各種方法固定在載體上，在一定的空間范圍進行生命活動的原生質體。固定化原生質體有利于氧氣和其他營養(yǎng)物質的傳遞和酶的分泌，可以顯著提高酶產率。固定化原生質體發(fā)酵產酶具有操作穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性。工藝條件控制需要注意：1、滲透壓的控制；2、防止細胞壁再生；3、保證原生質體的濃度。第四節(jié)植物細胞培養(yǎng)產酶植物細胞培養(yǎng)是從植物外植體中獲得植物細胞，然后在一定條件下進行培養(yǎng)，以獲得各種所需產物的技術過程。植物細胞培養(yǎng)培養(yǎng)產酶是20世紀80年代發(fā)展起來的技術，通過誘導從外植體獲得植物細胞，再經篩選、誘變、原生質體融合或基因重組選育優(yōu)質產酶細胞，在人工控制條件的反應器中進行培養(yǎng)產酶。植物細胞產酶同樣具有提高產率、縮短周期、提高產量等顯著優(yōu)點，且不受地理環(huán)境和氣候條件的影響，具有深遠的意義和廣闊的應用前景。一、植物細胞的特性1、植物細胞較大（直徑和體積）2、生長速率和代謝速率較低，生產周期較長3、營養(yǎng)要求簡單4、培養(yǎng)需要一定的光照強度和時間5、對剪切力敏感6、生產的產物不同于其它細胞培養(yǎng)二、植物細胞培養(yǎng)的特點1、產率高2、周期短3、易于管理，勞動強度低4、產品質量高三、植物細胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制1、溫度的控制室溫下（25℃）培養(yǎng)，范圍應控制在20~32℃。溫度高有利于細胞生長，溫度低有利于次級代謝產物的積累。2、pH的控制最適pH=5~6，在配制培養(yǎng)基時，應將培養(yǎng)基控制在pH=5.5~5.8。植物細胞培養(yǎng)過程中，pH變化較小。3、溶解氧的調節(jié)控制植物細胞代謝較慢，需氧量較小，過量的氧具有不良影響。另外植物細胞體積較大，對剪切力敏感，強烈的通風和攪拌會破壞植物細胞。4、光照的控制光照對植物細胞培養(yǎng)有重要影響。大多數(shù)植物細胞的生長以及次級代謝物的生產要求一定波長的光的照射，并對光照強度和時間有一定的要求。有些次級代謝物的生物合成會受到光的抑制。5、前體的添加前體是指目的代謝物代謝途徑上游的物質。在培養(yǎng)過程中添加前體物質可以有效的提高次級代謝物的產量。6、刺激劑的應用刺激劑可以促使植物細胞中的物質代謝朝著某些次級代謝產物生成的方向進行，提高次級代謝產物產率的提高。常用的刺激劑有微生物細胞壁碎片和果膠酶、纖維素等微生物胞外酶。四、植物細胞培養(yǎng)產酶的過程以大蒜細胞培養(yǎng)生產超氧化物歧化酶(SOD)為例：SOD具抗輻射、抗氧化、抗衰老等功效。1、大蒜愈傷組織的培養(yǎng)2、大蒜細胞懸浮培養(yǎng)3、