Chapter3CellDisruption

第三章細(xì)胞破碎技術(shù)2生物分離過程的一般流程本章內(nèi)容主要內(nèi)容第一節(jié)細(xì)胞破碎三、各種破碎方法的評述和選擇依據(jù)一、細(xì)胞破碎方法總表

二、細(xì)胞破碎方法第二節(jié)胞內(nèi)產(chǎn)物的溶解和復(fù)性第一節(jié)細(xì)胞破碎技術(shù)一、細(xì)胞破碎方法總表

一、細(xì)胞破碎方法破碎方式（是否受外加作用力）機械破碎法

非機械破碎法

固體剪切液體剪切高速珠磨法高壓勻漿法超聲波溶胞作用

脫水作用真空干燥空氣干燥冷凍干燥溶劑干燥

物理的化學(xué)的酶的

滲透壓沖擊凍結(jié)融化法陰陽離子抗生素等溶菌酶等

細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的研磨劑（D＜1mm的無鉛玻璃珠）在攪拌漿作用下充分混合，珠子之間，珠子與細(xì)胞之間互相剪切、碰撞，促使細(xì)胞壁破裂，釋出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出，從而實現(xiàn)連續(xù)操作，破碎中產(chǎn)生的熱量由夾套中的冷卻液帶走。（瑞士WAB公司和德國西門子機械公司制造）。1、珠磨法（High-speedbeadmill）

（1）破碎機理：（一）機械破碎法ZM系列臥式密閉珠(砂)磨機WSK臥式高效全能珠磨機Crushinginballmill珠磨法S為破碎率，k為破碎速率常數(shù)，主要與磨珠的大小、攪拌速度、攪拌漿的形狀、流量、細(xì)胞濃度、裝珠量及溫度等有關(guān)。

（2）動力學(xué)方程（一級反應(yīng)方程式）：Ln（）=ktt=（3）溫控與能耗：

珠磨機采用夾套冷卻的方式實現(xiàn)溫度控制的能耗與細(xì)胞破碎率成正比珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。珠磨法適用于細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理。（4）適用范圍:2、高壓勻漿法（Highpressurehomogenization）

由高壓泵和勻漿閥組成。從高壓室（幾百個大氣壓）壓出的細(xì)胞懸浮液經(jīng)過閥座的中心孔道從閥座和閥桿之間的小環(huán)隙噴出，速度可達幾百米每秒，這種高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出，細(xì)胞在高速造成的剪切力、碰撞力和高壓到常壓的變化等作用下，造成細(xì)胞破碎。（1）原理：大、中、小型高壓勻漿器高壓勻漿機采用高壓勻漿器（由高壓泵和勻漿閥組成，英國APV公司和美國Microfluidics公司均有產(chǎn)品出售）。（2）細(xì)胞破碎率：屬于一級反應(yīng)速率方程S:細(xì)胞破碎率K:破碎速度常數(shù)(破碎的阻力)P:操作壓力N:循環(huán)操作次數(shù)a、b指數(shù)因細(xì)胞種類和培養(yǎng)條件而異

細(xì)胞破碎的程度與溫度、壓力大小、勻漿次數(shù)、進料細(xì)胞懸浮液的濃度以及懸浮體系等有關(guān)，并呈線性關(guān)系。破碎的動力學(xué)方程:LnS=kPaNb總之：微生物形態(tài)（morphology）和生理狀態(tài)（physiology）決定了細(xì)胞的機械強度，破碎的參數(shù)Rmax、k、a、b、ρ等，隨細(xì)胞種類和培養(yǎng)條件的不同而有所差異。如指數(shù)a2.9(酵母)a=2.21（E.Coli）

1.77（產(chǎn)朊假絲酵母）

b、指數(shù)與細(xì)胞濃度和培養(yǎng)條件（如稀釋率）有關(guān)。

活性物失活與產(chǎn)生熱有關(guān)系，一般需多級操作，每次循環(huán)前要進行級間冷卻。

能耗：提供動力（ρ）+低溫維持的耗費（3）溫控與能耗：在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對于酵母等難破碎的及高濃度的細(xì)胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性菌，含有包含體的基因工程菌（因包含體堅硬，易損傷勻漿閥）不宜采用高壓勻漿法。（4）適用范圍:適用于酵母和大多細(xì)菌細(xì)胞的破碎,不適用于……（5）高壓勻漿法與高速珠磨法的特點的比較：

①操作參數(shù)②循環(huán)次數(shù)

③溫控和能耗④使用范圍1、機理：2、影響因素：3、適用范圍：3、超聲波破碎（ultrasonication）利用發(fā)射15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。一般認(rèn)為超聲波破碎的機理是：在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。

超聲波的細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能、液體溫度和粘度、處理時間等有關(guān)。超聲波破碎法是很強烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對酵母菌的效果較差。該法在實驗室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用。Ultrasonication超聲波超聲波破碎儀

超聲波清洗器(DL-720D)DL型系列超聲波清洗器除其本身具有高效，高質(zhì)量的清洗功能外，還具有“脫氣”、“提取”、“乳化”、“加速溶解”、“粉碎”、“分散”等多種功能。產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于各種需要清洗的物品。

SonicsVC750/VC500超聲波破碎儀適用于多種研究領(lǐng)域之多用途多功能的超聲破碎儀，它可處理由幾微升到多達幾百升的有機和無機樣品，能夠破碎各類細(xì)胞、細(xì)菌、孢子、組織，又可以打碎聚合物，乳化樣品，溶解難溶物質(zhì)，加速反應(yīng)，霧化液體，分散顆粒，制備樣品，氣化液體及清洗技術(shù)。1、化學(xué)滲透（Chemicalpermeation）某些化學(xué)試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。（二）非機械破碎法TritonX-100牛黃膽酸鈉十二烷基磺酸鈉（1）表面活性劑表面活性劑可促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞的破碎。主要是處理G-細(xì)菌，對細(xì)胞外層膜有破壞作用。EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來填補，從而導(dǎo)致內(nèi)層膜通透性的增強。（2）EDTA螯合劑能分解細(xì)胞壁中的類脂，使胞壁膜溶脹，細(xì)胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。乙醇、異丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級醇等。（3）有機溶劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。鹽酸胍和脲是常用的變性劑。通用性差；時間長，效率低；有些化學(xué)試劑有毒?；瘜W(xué)滲透法優(yōu)點：缺點：對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。不足：

易引起生化物質(zhì)的變性，須在低溫下操作，帶來分離、回收化學(xué)試劑的問題。如苯、甲苯、抗生素、SDS、EDTA、變性劑（鹽酸胍脲）等化學(xué)藥品可改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物質(zhì)選擇地滲透出來這種處理方式稱為化學(xué)滲透法自溶作用。

作用機理：應(yīng)用：化學(xué)滲透與機械法比較的優(yōu)、缺點:

①、②、③（1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶β-1，3-葡聚糖酶β-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽鍵內(nèi)切酶殼多糖酶等2、酶溶法（Enzymaticlysis）：原理外源性酶解—溶菌酶、糖苷酶（β-1,4、β–1,6）、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白水解酶、α-淀粉酶、纖維素酶、脂酶等內(nèi)源性酶解（自溶）——溫度、pH、時間、緩沖液濃度、激活劑等酶選擇性的催化細(xì)胞壁反應(yīng)，不破壞細(xì)胞內(nèi)的其它物質(zhì)。溶菌酶是應(yīng)用最多的酶，它能專一地分解細(xì)胞壁上糖蛋白分子的β一l，4糖苷鍵，使脂多糖解離，經(jīng)溶菌酶處理后的細(xì)胞移至低滲溶液中使細(xì)胞破裂。溶菌酶適用于革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的分解。對于革蘭氏陰性菌需輔以EDTA。真核細(xì)胞的細(xì)胞壁需采用不同的酶。蝸牛酶適于酵母細(xì)胞的處理（2）自溶法（Autolysis）誘發(fā)微生物產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達到細(xì)胞自溶的目的。影響自溶過程的主要因素有溫度、時間、pH值、激活劑和細(xì)胞代謝途徑等。缺點：對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。應(yīng)用：用酶溶法剝離細(xì)胞壁，將原生質(zhì)體進行融合，細(xì)胞工程常用的方法。酶溶法處理細(xì)胞存在的問題：①存在酶產(chǎn)物的抑制問題，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放率降低。②酶價高，限制了大規(guī)模應(yīng)用。目前僅用于實驗室規(guī)模。③通用性差，不同的菌株用不同的酶。3、物理滲透法原理:適用范圍:（2）反復(fù)凍結(jié)—融化法：機理：適用范圍：（3）干燥法：（1）滲透壓沖擊法(Osmotichock):（1）目前在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞破碎方法：有高壓勻漿法和高速珠磨機法。（2）機械破碎法中存在的共同問題：（三）各種破碎方法的比較及選擇1、主要破碎方法的比較（參見P39-40）（4）物理法：（5）干燥法：較劇烈的一種破碎方法。滲透壓沖擊、反復(fù)凍結(jié)—融化法。（3）非機械法中化學(xué)法和酶法應(yīng)用最廣泛：酶法自溶法抑制細(xì)胞壁合成的方法細(xì)胞的處理量和細(xì)胞壁的強度；目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件（溫度、化學(xué)試劑、酶等）的敏感性要達到的破碎程度及破碎所必要的速度等具有大規(guī)模應(yīng)用潛力的生化產(chǎn)品應(yīng)選擇適合于放大的破碎技術(shù)把破碎條件和后面的提取步驟結(jié)合起來2、主要破碎方法的選擇依據(jù)

在固—液分離中細(xì)胞碎片的大小是重要因素，太小的碎片很難分離除去，因此，破碎時既要獲得較高的產(chǎn)物的釋放率又不能使細(xì)胞碎片太小。適宜的細(xì)胞破碎條件應(yīng)該從高的產(chǎn)物釋放率，低的能耗和便于后步提取這三方面來權(quán)衡。選擇的一般原則：A、提取產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，用機械法破碎B、提取產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，用化學(xué)法C、提取產(chǎn)物與細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機械法結(jié)合的方法綜合說明由于細(xì)胞之間及目標(biāo)產(chǎn)物之間性質(zhì)差異很大，已有的破碎理論、破碎實驗數(shù)據(jù)只能作為指導(dǎo)破碎操作的參考依據(jù)。實際的破碎操作仍憑經(jīng)驗，即通過實驗確定適宜的破碎器和破碎操作參數(shù)，獲得最佳破碎效率。提高破碎率意味著延長破碎操作時間或增加破碎操作次數(shù)，后者往往引起目標(biāo)產(chǎn)物的變性或失活。機械法與酶法破碎的比較機械粉碎法：處理量大，破碎速度較快。細(xì)胞受到由高壓產(chǎn)生的高剪切力，大多數(shù)情況下要采取冷卻措施，以便除去由于消耗機械能而產(chǎn)生的過多熱量，防止生化物質(zhì)破壞酶解需要選擇適宜的酶和酶系統(tǒng)，并要決定特定的反應(yīng)條件，還常附加其它的處理，如輻照、加高濃度鹽及EDTA，或者利用生物因素等促使微生物對酶解作用敏感，以獲得一定的效果。選擇合適的破碎方法需要考慮的因素：細(xì)胞的數(shù)量，目的產(chǎn)物對破碎條件（溫度、化學(xué)試劑、酶等）的敏感性；破碎程度及破碎速度等。

物理法和化學(xué)法的比較

物理破碎法缺點：A、高能、高溫、高噪音、高剪切力(四高)，易使產(chǎn)品變性失活；B、非專一性，胞內(nèi)產(chǎn)物均釋放，分離純化困難；C、細(xì)胞碎片大小不一，難分離。

化學(xué)破碎法缺點：A、費用高；B、引起新的污染，尤其是其他化學(xué)方法；C、一般只有有限的破碎，常需與其他物理法連用。分類作用機理適應(yīng)性機械法珠磨法固體剪切作用可達較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難高壓勻漿法液體剪切作用可達較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽性菌超聲破碎法液體剪切作用對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作X-press法固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對冷凍敏感目的產(chǎn)物不適合非機械法酶溶法酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價格高，通用性差化學(xué)滲透法改變細(xì)胞膜的滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差滲透壓法滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用凍結(jié)融化法反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，不適合對冷凍敏感目的產(chǎn)物干燥法改變細(xì)胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活每一步都應(yīng)注意全面考慮操作度、對細(xì)胞的剪切程度、蛋白酶的失活作用等。在選擇細(xì)胞破碎時也要考慮后面的各步。細(xì)胞破碎是為目標(biāo)產(chǎn)物的釋放創(chuàng)造條件，為了最大程度的獲得活性產(chǎn)物，而不是最終目的。（包涵體的分離和蛋白質(zhì)復(fù)性）第二節(jié)胞內(nèi)產(chǎn)物的溶解和復(fù)性

重組DNA技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)提供了嶄新的途徑，開辟了現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的新紀(jì)元。但是，人們在分離純化基因工程表達產(chǎn)物時遇到了意想不到的困難，很多利用大腸桿菌為宿主細(xì)胞的外源基因表達產(chǎn)物（如尿激酶、人胰島素、人生長激素、白細(xì)胞介素－６、人γ－干擾素等）不僅不能分泌到細(xì)胞外、而且在細(xì)胞內(nèi)凝聚成沒有生物活性的固體顆粒，（inclusionbodiesIBs)。稱為包含體一、包含體的概念及其形成：外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白/%外源蛋白的積累人胰島素50%形成包涵體β-丙酰胺酶20%在細(xì)胞間區(qū)γ-人體干擾素25%形成包涵體凝乳酶原形成包涵體牛生長激素>30%形成包涵體β-內(nèi)酰胺酶形成間區(qū)包涵體人胰島素原5%~26%形成包涵體2、包含體的形成：

一般認(rèn)為包含體的形成是外源蛋白質(zhì)在生成的過程中，缺少某些協(xié)助因子或者由于周圍的物理環(huán)境（如I、T等）不適，使其難以連續(xù)進行次級鍵的形成，中間產(chǎn)物相互凝集而積累成包含體。目標(biāo)蛋白的復(fù)性

包含體（inclusionbodies）是無定形的蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍。細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密，低速離心就可以沉淀。包含體顆粒難溶于水，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中顆粒才能溶解。在這些溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級結(jié)構(gòu)和共價鍵不被破壞。因此當(dāng)除去變性劑時，一部分蛋白質(zhì)可以自動折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。以包涵體形式表達蛋白的優(yōu)勢①富含目的產(chǎn)物，有利于后續(xù)的分離純化；②沉積于包涵體的目標(biāo)產(chǎn)物不易被蛋白酶水解；③對于對宿主細(xì)胞有毒害或殺傷作用的目的產(chǎn)物，以包涵體形式表達有利。

細(xì)胞破碎離心細(xì)胞→→→胞勻漿液→→→包涵體