做純化似拂輕塵,制填料如煮小鮮

第三章層析概況2023/2/51層析法或稱色譜法（chromatography）是一種物理或物理化學(xué)的分離分析方法。2023/2/52層析方法的分類：柱層析：名稱原理基質(zhì)或載體吸附層析疏水力和靜電引力硅膠、氧化鋁、羥基磷灰石、活性炭等分配層析、反向分配層析溶解度纖維素、硅藻土、硅膠等反向?qū)游?、疏水層析疏水力和靜電引力苯基、辛基、丁基葡聚糖凝膠或C18離子交換層析離子間結(jié)合力樹脂、離子型纖維素和葡聚糖凝膠，人造沸石。親和層析親和力帶配基的葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠凝膠過濾層析排阻效應(yīng)交聯(lián)葡聚糖凝膠和交聯(lián)瓊脂糖凝膠聚焦層析電荷效應(yīng)及離子間結(jié)合力多緩沖離子交換劑高效液相層析隨固定相變化而變化離子交換，親和，凝膠過濾等填料氣相層析與吸附層析和分配層析同吸附劑或有機(jī)溶劑液膜2023/2/53薄層層析：紙層析：濾紙分配層析：溶解度，濾紙。名稱原理基質(zhì)或載體吸附層析疏水力和靜電引力硅膠、氧化鋁等分配層析溶解度纖維素、硅膠、硅藻土離子交換層析離子間結(jié)合力各種離子交換劑凝膠過濾層析排阻效應(yīng)交聯(lián)葡聚糖聚酰胺薄膜層析疏水力和靜電引力聚酰胺2023/2/54一、常用術(shù)語：1、固定相：是由層析基質(zhì)組成?；|(zhì)包括固體物質(zhì)（吸附劑、離子交換劑）和液體物質(zhì)（固定在纖維素或硅膠上的溶液），這些物質(zhì)能與相關(guān)的化合物進(jìn)行可逆性的吸附、溶解和交換作用。2、流動(dòng)相：層析過程中推動(dòng)固定相上的物質(zhì)向一定方向移動(dòng)的液體或氣體稱為流動(dòng)相。在柱層析時(shí)，流動(dòng)相又稱為洗脫劑。在薄層層析時(shí)流動(dòng)相又稱為展層劑。3、層析：以基質(zhì)為固定相，以液體或氣體為流動(dòng)相，有效成分和雜質(zhì)在這兩個(gè)相中連續(xù)多次的進(jìn)行分配、吸附或交換作用，最終使混合物得到分離。4、操作容量：在特定條件下，某種成分與基質(zhì)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，存在于基質(zhì)上的飽和容量，一般以每克（或毫升）基質(zhì)結(jié)合某種成分的毫摩爾數(shù)或毫克數(shù)開表示。其數(shù)值大表示對某成分的結(jié)合力強(qiáng)。5、膨脹度：在一定溶液中，單位重量的基質(zhì)充分溶脹后所占有的體積用Vβ表示。即每克溶脹基質(zhì)所具有的床體積。一般親水性基質(zhì)的膨脹度比疏水性的大。第一節(jié)：柱層析2023/2/556、外水體積（Vo）：是基質(zhì)顆粒之間的體積總和。7、內(nèi)水體積（Vi）：是基質(zhì)顆粒內(nèi)部的體積總和。8、基質(zhì)體積（Vg）：是基質(zhì)自身所具有的體積。

Vo、Vi、Vg都是隨著床體積和基質(zhì)性質(zhì)變化而變化的。9、床體積（Vt）：通常床體積是指膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積（Vt）。Vt是基質(zhì)的外水體積Vo和內(nèi)水體積Vi以及自身體積Vg的總合。

Vt=Vo+Vi+Vg10、洗脫體積（Ve）：是指某一組分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達(dá)到最大值時(shí)的流動(dòng)相體積。11、分配系數(shù)和遷移率：分配系數(shù)是指一組分在固定相與流動(dòng)相中含量的比值，常用K表示。而遷移率是指一組分在相同時(shí)間內(nèi)，在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相移動(dòng)距離之比值，常用Rf表示。K值越大，表明該組分與固定相的親和力大，遷移率小。K值可以作為定性參數(shù)。2023/2/56二、基本原理A+BA+BABBA色譜法的分離原理主要是利用物質(zhì)在流動(dòng)相與固定相中的分配系數(shù)的差異而被分離。當(dāng)兩相相對運(yùn)動(dòng)時(shí)，樣品中各組分將在兩相中多次分配，分配系數(shù)大的組分遷移速度慢，反之遷移速度快而被分離。2023/2/57混合組分的分離過程及檢測器對各組份在不同階段的響應(yīng)2023/2/58三、色譜參數(shù)色譜法中常用的參數(shù)包括：定性參數(shù)、定量參數(shù)、柱效參數(shù)、分離參數(shù)及相平衡參數(shù)等。1、色譜流出曲線：樣品被流動(dòng)相沖洗，通過色譜柱，留經(jīng)檢測器所形成的濃度信號(hào)隨洗脫時(shí)間或洗脫體積而繪制的曲線，稱為色譜流出曲線，即濃度-時(shí)間曲線。檢測器（一）色譜流出曲線與色譜峰2023/2/592、基線（baseline）：檢測器中只有流動(dòng)相通過或雖有樣品的濃度變化而不能被檢測器所檢出時(shí)，所給出的流出曲線稱為基線。正?；€：基線的高低反映檢測器的本底高低，基線主要由流動(dòng)相中所含的雜質(zhì)等因素決定。噪音（noise；RN）：各種未知的偶然因素引起的基線起伏的現(xiàn)象稱為噪音。噪音的大小用噪音帶的寬度來衡量。漂移（drift；d）：極限隨時(shí)間朝某一方向的緩慢變化，稱為漂移。主要由實(shí)驗(yàn)條件不穩(wěn)定引起的。3、色譜峰（peak）或色譜帶（band）：色譜流出曲線上突起的部分稱為色譜峰。正常的色譜峰為對稱形正態(tài)分布曲線，曲線有最高點(diǎn)，以此點(diǎn)的橫坐標(biāo)為中心，曲線對稱地向兩側(cè)快速單調(diào)下降。不正常的色譜峰：拖尾峰及前延峰。對稱因子（fs）：正常峰和不正常峰可用對稱因子來衡量，

fs=（B+A）/2A峰高（或峰面積）：用于定量；峰位：用于定性；峰寬：用于衡量柱效。2023/2/510（二）定性參數(shù)1、保留時(shí)間：保留時(shí)間（tR）：從進(jìn)樣開始到某個(gè)組分的色譜峰頂?shù)臅r(shí)間間隔，稱為該組分的保留時(shí)間。死時(shí)間（t0）不被固定相吸附或溶解的組分的保留時(shí)間稱為死時(shí)間。調(diào)整保留時(shí)間：

tR`=tR-t02、保留體積（VR）：又稱洗脫體積。保留體積：流動(dòng)相攜帶樣品進(jìn)入色譜柱，由進(jìn)樣開始，到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)，所需流動(dòng)相通過色譜柱的體積。死體積：由進(jìn)樣器到檢測器出口，未被固定相所占有的空間。包括管路，固定相顆粒間隙及檢測器內(nèi)腔等。死體積大，被分離組分?jǐn)U散，色譜峰變寬。調(diào)整保留體積：扣除死體積后的保留體積稱為調(diào)整保留體積。3、比移值（Rf）定時(shí)展開：薄層色譜中，一般都采用定時(shí)展開：觀察同一展開時(shí)間中，組分與展開溶劑的遷移距離。Rf=l/l0定距展開：記錄組分與流動(dòng)相通過相同距離所需時(shí)間的展開方式，成為定距展開。在液相色譜中都采用這種方式。Rf=t0/tR2023/2/511（三）柱效參數(shù)色譜柱的柱效通常用理論塔板數(shù)或有效塔板數(shù)來衡量，而他們?nèi)Q于區(qū)域?qū)挾取?、區(qū)域?qū)挾葮?biāo)準(zhǔn)偏差（δ）：標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中物質(zhì)的分散程度。δ小，則分散程度小，峰形窄、柱效高。反之，峰形寬，柱效低。半峰寬（W1/2）：色譜峰高一半處的峰寬。峰寬（W）：又稱基線寬度。W=1.699W1/22023/2/512理論塔板數(shù)（n）：是衡量柱效的指標(biāo)。理論塔板數(shù)取決于固定相種類、性質(zhì)（粒度、粒度分布等），填充（或涂布）狀況、柱長（或板長），流動(dòng)相的流速及測定柱效（或板效）所用物質(zhì)有關(guān)。在液相色譜法中還與流動(dòng)相的種類性質(zhì)有關(guān)。n=(tR/δ)2;δ=1/2.355×W1/2n=5.54(tR/W1/2)2理論塔板高度（H）：H=L/n2、理論塔板數(shù)與理論塔板高度塔板理論是把色譜柱假想為一個(gè)精餾塔，塔內(nèi)存在許多塔板，組分在每個(gè)塔板的氣相和液相間進(jìn)行分配，達(dá)成一次分配平衡。然后隨著流動(dòng)相按一個(gè)塔板、一個(gè)塔板的方式向前移動(dòng)。經(jīng)過多次分配平衡后，分配系數(shù)小的組分，先離開蒸餾塔（色譜柱），分配系數(shù)大的組分后離開蒸餾塔（色譜柱），從而使分配系數(shù)不同的組分彼此得到分離。

2023/2/513范德姆特方程1956年，荷蘭學(xué)者范德姆特（VanDeomter）等提出一個(gè)描述色譜柱分離過程中復(fù)雜因素使色譜峰擴(kuò)寬而致柱效降低（即：使H增大）影響的方程。此方程經(jīng)簡化后寫為:

A——渦流擴(kuò)散項(xiàng),

反映溶質(zhì)分子受固定相顆粒障礙改變移動(dòng)方向，形成渦流引起擴(kuò)散。與填充顆粒的大小及填充的均勻性有關(guān)，而與流動(dòng)相的流速無關(guān)。A越大，色譜峰變寬更嚴(yán)重?！?/p>

分子擴(kuò)散項(xiàng)，溶質(zhì)區(qū)帶前后存在著濃度差，因而產(chǎn)生縱向擴(kuò)散使區(qū)帶（色譜峰）擴(kuò)寬，擴(kuò)散的嚴(yán)重與否，關(guān)鍵是取決于流動(dòng)相的線速度?！潭ㄏ鄠髻|(zhì)阻力項(xiàng)——流動(dòng)相傳質(zhì)阻力項(xiàng)此兩項(xiàng)對色譜峰的影響均與流速成正比。在流速很高的情況下，由于沒有足夠的時(shí)間建立平衡，偏離更為嚴(yán)重。U－流動(dòng)相的平均線速度2023/2/514（四）分離參數(shù)1、分離度（resolution，R）：相鄰兩峰分開的距離是平均峰寬[(W1+W2)/2]的幾倍，稱為分離度。①分離效果差，柱效低，選擇性（

）低②完全分離，柱效高，峰窄，選擇性（

）低；③完全分離，選擇性（

）增加，柱效低，峰寬④完全分離，柱效高，選擇性（）好色譜分離中的四種典型情況R=2（l2-l1）/（W1+W2）2023/2/515R越大，相鄰組分分離越好。當(dāng)R=1.5時(shí)，分離程度可達(dá)99.7%，因此R=1.5通常用作是否分開的判據(jù)。R=1.5R=0.75R=1.0響應(yīng)信號(hào)保留時(shí)間t,min2023/2/5162、色譜分離方程

R的定義并未反映影響分離度的各種因素。也就是說，R未與影響其大小的因素：柱效n、選擇因子和保留因子k聯(lián)系起來。

稱為分配系數(shù)比（K2/K1）或容量因子比（k2/k1）abca項(xiàng)稱為柱效項(xiàng)，柱效高則a項(xiàng)大。b稱為柱選擇項(xiàng)，c為柱容量項(xiàng)，這兩項(xiàng)相關(guān)，受色譜柱性質(zhì)及流動(dòng)相性質(zhì)影響。2023/2/517五、層析柱的制備與層析操作柱層析的設(shè)備：層析柱、部分收集器、恒流泵，檢測器流動(dòng)相檢測器2023/2/5181、填料的選擇：要分離物質(zhì)的性質(zhì)2、層析柱的選擇：直徑與柱長的比例：1:10-1:40層析柱的床體積是由要處理樣品的量來決定的。3、填料的用量：一般為待分離樣品的30-50倍。4、裝柱：裝填均勻，松緊一致，沒有氣泡。5、上樣和洗脫：上樣液體積小于床體積的1/2，體積越小越有助于分離效果。洗脫液的流速要恰當(dāng)控制6、填料的再生：不同基質(zhì)的再生方法不同。2023/2/519第二節(jié)、薄層層析薄層層析（thinlayerchroomatographyTLC）：是以涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質(zhì)為固定相，以液體為流動(dòng)相的一種層析方法。根據(jù)固定相的種類分類：吸附薄層層析分配薄層層析離子交換薄層層析優(yōu)點(diǎn)：展層時(shí)間短15min-60min

設(shè)備簡單，操作方便，既適于分析也適于制備影響因素少，結(jié)果重現(xiàn)性好顯色方法多樣，靈敏度高。2023/2/520操作及注意事項(xiàng)：1