CCSC05CITST/CITS257—2025-中國檢驗檢測學(xué)會發(fā)布T/CITS257—2025前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14儀器與試劑 15試驗要求 26結(jié)果報告 37質(zhì)量控制 48操作安全 49數(shù)據(jù)庫更新 4附錄A（資料性）MS鑒定結(jié)果報告類型 6參考文獻(xiàn) 8T/CITS257—2025本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由北京市朝陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心和國軍標(biāo)（北京）標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)研究院提出。本文件由中國檢驗檢測學(xué)會歸口。本文件起草單位：北京市朝陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心、國軍標(biāo)（北京）標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)研究院、北京實(shí)安科技有限公司、中日友好醫(yī)院、北京大學(xué)人民醫(yī)院、解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心、北京醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)會、北京中檢體外診斷工程技術(shù)研究中心、海口佳新益科技有限公司、海南醫(yī)學(xué)院海南省創(chuàng)傷與災(zāi)難救援研究重點(diǎn)實(shí)驗室、湖北省臨床檢驗中心、上海健康醫(yī)學(xué)院、威海市立醫(yī)院、通標(biāo)偉業(yè)（北京）標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)研究院。本文件主要起草人：孫靈利、劉潔、劉萬陽、李娜、戴其全、馬亮、華文浩、段晉燕、陳剛、穆紅、王超、于法標(biāo)、郭小曼、王明義、馬淑青、王大利、王燕。T/CITS257—2025微生物快速鑒定質(zhì)譜法本文件規(guī)定了采用質(zhì)譜法進(jìn)行微生物鑒定的儀器與試劑、試驗要求、結(jié)果報告、質(zhì)量控制、操作安全和數(shù)據(jù)庫更新的要求。本文件適用于公共衛(wèi)生、臨床檢驗、食品檢測、環(huán)境檢測等領(lǐng)域利用質(zhì)譜法進(jìn)行微生物快速鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件GB4789.10—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗GB/T6682分析實(shí)驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T18204.3—2013公共場所衛(wèi)生檢驗方法第3部分：空氣微生物GB19489實(shí)驗室生物安全通用要求WS/T807臨床微生物培養(yǎng)、鑒定和藥敏檢測系統(tǒng)的性能驗證3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1質(zhì)譜法massspectrometry；MS通過測定帶電離子質(zhì)量/電荷比（m/z，簡稱質(zhì)荷比）而進(jìn)行定性、定量檢測的一種現(xiàn)代分析技術(shù)。4儀器與試劑4.1實(shí)驗室應(yīng)配備微生物質(zhì)譜鑒定的儀器設(shè)備，包括但不限于：a)MALDI-TOFMS質(zhì)譜儀；b)離心機(jī)；c)恒溫培養(yǎng)箱；d)渦旋振蕩器；e)移液器；f)生物安全柜；g)接種環(huán)；h)靶板；2T/CITS257—2025i)滅菌設(shè)備。4.2實(shí)驗室應(yīng)配備但不限于以下試劑：a)甲酸（HCOOH)；b)乙腈(CHCN)；c)乙醇(CHCH2OH)；d)血瓊脂培養(yǎng)基：按照GB4789.10—2016中A.2的規(guī)定執(zhí)行；e)沙氏瓊脂培養(yǎng)基：按照GB/T18204.3—2013中4.2.2.1的規(guī)定執(zhí)行；f)標(biāo)準(zhǔn)菌株：ATCC8739大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）。5試驗要求5.1菌株準(zhǔn)備5.1.1應(yīng)采用新鮮培養(yǎng)的單個菌落，微生物培養(yǎng)時間見表1。表1不同類型微生物培養(yǎng)時間5.1.2細(xì)菌宜選用血瓊脂平板培養(yǎng)基，真菌宜選用沙氏培養(yǎng)基。5.1.3宜使用固體培養(yǎng)基；如果使用液體培養(yǎng)基，應(yīng)在分析前進(jìn)行富集及洗滌操作，用純培養(yǎng)物進(jìn)行檢測。5.1.4凍存菌株應(yīng)傳代2次后使用。5.1.5微生物前處理方法見表2。在各個MALDI-TOFMS上的微生物前處理方法應(yīng)由生產(chǎn)商進(jìn)行驗證并提供。表2不同微生物適用的前處理方法T/CITS257—2025表2不同微生物適用的前處理方法（續(xù)）先用乙醇滅活后再分別使用70%甲酸和100%乙腈進(jìn)行提5.2靶點(diǎn)點(diǎn)樣5.2.1應(yīng)先將質(zhì)控菌株/蛋白標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)在靶板相應(yīng)孔位，再點(diǎn)處理好的待測菌落。應(yīng)使用一次性接種環(huán)或無菌竹簽輕輕涂抹，使菌苔在靶點(diǎn)上形成一層均勻的薄膜。5.2.2點(diǎn)樣后加入基質(zhì)液，應(yīng)完全干燥形成結(jié)晶后再進(jìn)行檢測。5.2.3靶板準(zhǔn)備完成后，如為細(xì)菌或酵母菌，應(yīng)在48h內(nèi)完成檢測；如為分枝桿菌，應(yīng)在4h內(nèi)完成檢測；如曲霉菌等絲狀真菌，應(yīng)5min內(nèi)完成檢測。5.2.4菌株處理時耗材應(yīng)潔凈無污染，用于涂布靶板的一次性接種環(huán)等工具不應(yīng)重復(fù)使用，滴加基質(zhì)液的移液器吸頭在每涂完一個靶點(diǎn)后應(yīng)進(jìn)行更換。5.3試驗流程5.3.1定標(biāo)校準(zhǔn)5.3.1.1每批次檢測前，應(yīng)先使用定標(biāo)品將關(guān)鍵的儀器參數(shù)調(diào)整到最佳檢測狀態(tài)。5.3.1.2可選以下定標(biāo)品，或選用制造商建議的標(biāo)準(zhǔn)菌株：a)ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株（如大腸埃希菌ATCC8739）；b)細(xì)菌檢測標(biāo)準(zhǔn)品（bacteriateststandard，BTS）。5.3.2靶板載入應(yīng)待靶板完全干燥后將靶板載入真空倉，裝載或取出靶板的過程中應(yīng)戴無粉乳膠手套。5.3.3圖譜獲取5.3.3.1將樣品靶板放入儀器內(nèi)，設(shè)定合適的激光能量，質(zhì)譜掃描范圍等參數(shù)，開始質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。5.3.3.2圖譜的獲取由系統(tǒng)按照標(biāo)準(zhǔn)采集路徑進(jìn)行，如果使用手工采集，應(yīng)獲取足夠多的數(shù)據(jù)后再進(jìn)行分析。6結(jié)果報告6.1MS鑒定結(jié)果在報告之前，應(yīng)由微生物專業(yè)人員進(jìn)行審核，審核過程中可結(jié)合樣本來源、染色結(jié)果、形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)條件等特征對結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行評判。6.2MS檢測可得到以下幾種鑒定結(jié)果：T/CITS257—20254a)高置信的鑒定結(jié)果；b)多個鑒定結(jié)果，且每個結(jié)果的置信度相似；c)無鑒定結(jié)果。6.3根據(jù)具體情況，應(yīng)鑒定到微生物的屬、種或亞種水平，并標(biāo)注置信度等。6.4不同MS系統(tǒng)結(jié)果的判讀方式應(yīng)參考制造商的說明，參見附錄A。7質(zhì)量控制7.1應(yīng)對操作人員進(jìn)行初次和定期（至少6個月一次）培訓(xùn)以及能力考核，培訓(xùn)的內(nèi)容包括原理方法、信息技術(shù)、儀器維護(hù)、結(jié)果報告與解釋等，應(yīng)對培訓(xùn)者進(jìn)行人員比對和/或考核，確保不同操作人員鑒定的一致性。7.2質(zhì)譜儀應(yīng)具備穩(wěn)定的性能，符合相關(guān)認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)和制造商宣稱能達(dá)到的指標(biāo)。在引入新系統(tǒng)時，應(yīng)對試劑、數(shù)據(jù)庫、分析軟件和硬件等進(jìn)行全面驗證后再使用，驗證方案可依據(jù)WS/T807。7.3檢測前儀器應(yīng)進(jìn)行自身校準(zhǔn)，校準(zhǔn)通過后方可進(jìn)行后續(xù)鑒定。7.4應(yīng)按照制造商的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（standardoperatingprocedure；SOP）文件要求，在靶板清洗、基質(zhì)溶液及標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制后每次進(jìn)行陰性及陽性對照的質(zhì)量控制，每次病原體鑒定時都應(yīng)重復(fù)相同操作。7.5陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控應(yīng)與每日檢測的標(biāo)本同時進(jìn)行，并將每日的質(zhì)控結(jié)果進(jìn)行記錄。在失控期間，應(yīng)暫停使用系統(tǒng)進(jìn)行常規(guī)臨床樣本的檢測，直至找出問題的原因，解決后通過質(zhì)控。7.6陽性對照應(yīng)設(shè)置有臨床代表性的標(biāo)準(zhǔn)菌株，陽性質(zhì)控菌株的選擇應(yīng)根據(jù)實(shí)驗室的檢測范圍進(jìn)行。7.7陰性對照應(yīng)使用空白試劑，以證明試劑和靶板（若使用重復(fù)利用靶板）未發(fā)生污染，有效避免假陽性結(jié)果。7.8當(dāng)質(zhì)控結(jié)果失控或校準(zhǔn)未通過時，應(yīng)從各環(huán)節(jié)分析原因并予以糾正。常見原因包括但不限于：a)質(zhì)控菌株/蛋白標(biāo)準(zhǔn)品污染；b)使用錯誤的質(zhì)控菌株/蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；c)使用錯誤的試劑；d)操作人員的操作失誤。7.9記錄分析失控原因并歸檔。7.10如果未發(fā)現(xiàn)上述明顯的原因可重復(fù)測定質(zhì)控菌株/蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果在控，可直接進(jìn)行后續(xù)檢測；若不能糾正，應(yīng)聯(lián)系制造商采取相應(yīng)的措施。7.11應(yīng)定期參加可獲取的室間質(zhì)評活動，當(dāng)出現(xiàn)室間質(zhì)評不符時，及時找到失控原因并糾正。保存每次室間質(zhì)評信息，包括結(jié)果反饋、糾正措施等。7.12無適合的室間質(zhì)評計劃時，實(shí)驗室可與其它同類實(shí)驗室進(jìn)行室間比對。8操作安全8.1使用MS鑒定微生物時，樣本的接收、操作和處理都應(yīng)符合GB19489的要求。在鑒定高致病性或疑似高致病性病原菌時，實(shí)驗室應(yīng)使用已驗證有效的滅活方法，充分滅活后提取蛋白。8.2進(jìn)行樣本前處理時涉及到的化學(xué)試劑應(yīng)按實(shí)驗室操作規(guī)程使用和存儲，工作時應(yīng)佩戴口罩、手套，穿著工作服，做好個人防護(hù)。9數(shù)據(jù)庫更新T/CITS257—2025宜定期對質(zhì)譜儀的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行擴(kuò)展，提升菌種鑒定的種類和準(zhǔn)確性。對于數(shù)據(jù)庫中未包含的微生物，可根據(jù)實(shí)際工作需求自建數(shù)據(jù)庫。6T/CITS257—2025（資料性）MS鑒定結(jié)果報告類型A.1鑒定結(jié)果為分值和一致性的報告A.1.1概述鑒定結(jié)果為分值和一致性表示的質(zhì)譜儀，除單一種水平鑒定結(jié)果顯示以外，在報告中同時給出株水平10個參考結(jié)果及其一致性分析（以A、B、C表示其結(jié)果可根據(jù)表A.1中原則進(jìn)行報告。表A.1鑒定結(jié)果為分值和一致性的報告基本分類1A2B4B3C5C6<1.7007A.1.2A.1.2當(dāng)?shù)玫礁咧眯哦?≥2.000分，B）的鑒定結(jié)果時，應(yīng)注意檢查一致性，排除是否存在混合菌的情況，確定是否需要進(jìn)行補(bǔ)充或重復(fù)實(shí)驗。A.1.3當(dāng)?shù)玫降椭眯哦龋?.700分～1.999分，B）的鑒定結(jié)果時，可綜合排名前10位參考結(jié)果報告菌屬結(jié)果，如得到種水平準(zhǔn)確鑒定結(jié)果，應(yīng)再進(jìn)行重復(fù)或補(bǔ)充實(shí)驗。A.1.4無鑒定結(jié)果/圖譜無峰時1.700分或＜0）應(yīng)檢查圖譜質(zhì)量、樣本制備流程及儀器狀態(tài)，可根據(jù)表A.2進(jìn)行問題排查，選擇重新測試或選擇其他鑒定方法進(jìn)行鑒定。表A.2常見問題原因及處理方法7T/CITS257—2025A.2鑒定結(jié)果為概率的報告A.2.1報告分類見表A.3。表A.3鑒定結(jié)果為以概率為報告的基本分類1A.2.2A.2.2好的單一鑒定結(jié)果，可信度60.0%～99.9%：可直接報告；但對于帶有“!”的重要致病菌，應(yīng)用其他方法確認(rèn)后才可報告。如：當(dāng)系統(tǒng)將鑒定結(jié)果報告為B.anthracis（炭疽芽孢桿菌）或Y.pestis（鼠疫耶爾森菌）時，應(yīng)報告疾控部門進(jìn)行確認(rèn)。A.2.3低分辨結(jié)果，報告2個～4個鑒定選項，原因如下：a)假低分辨：建庫時2種～3種菌特征太相近，因數(shù)據(jù)庫本身低分辨而無法區(qū)別。b)真低分辨：存在混合菌、質(zhì)譜特異性峰缺失或多余，造成與數(shù)據(jù)庫中多個菌匹配；或數(shù)據(jù)庫中沒有該菌而匹配上近似菌。A.2.4A.2.4鑒定失敗，無鑒定結(jié)果，原因如下：a)定標(biāo)未通過：可能由于校準(zhǔn)點(diǎn)位的定標(biāo)菌株涂布質(zhì)量不高導(dǎo)致，宜用新鮮的校準(zhǔn)菌株（ATCC8739）重新涂靶板，或微調(diào)儀器參數(shù)；b)圖譜獲取成功，但可用的波峰數(shù)量太少，不足以進(jìn)行分析運(yùn)算，宜重新獲取圖譜；c)待檢測菌不在數(shù)據(jù)庫中，宜用其他方法鑒定。T/CITS257—20258參考文獻(xiàn)[1]GB/T33682—2017基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜鑒別微生物方法通則[2]GB/T42580—2023智能實(shí)驗室微生物質(zhì)譜鑒定平