犐犆犛１１．２２０

犅４１

中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

犖犢／犜６７９—２００３

豬繁殖與呼吸綜合癥免疫酶試驗方法

犈狀狕狔犿犲犻犿犿狌狀狅犪狊狊犪狔犳狅狉狆狅狉犮犻狀犲狉犲狆狉狅犱狌犮狋犻狏犲犪狀犱狉犲狊狆犻狉犪狋狅狉狔狊狔狀犱狉狅犿犲

２００３０７３０發(fā)布２００３１００１實施

中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布

書

犖犢／犜６７９—２００３

前言

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄Ａ為規(guī)范性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王宏偉、王傳彬、陳西釗、田克恭。

Ⅰ

書

犖犢／犜６７９—２００３

豬繁殖與呼吸綜合癥免疫酶試驗方法

１范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬繁殖與呼吸綜合癥（ＰＲＲＳ）免疫酶試驗和免疫酶組織化學(xué)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測豬血清中的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（ＰＲＲＳＶ）抗體和組織中的ＰＲＲＳＶ抗原。

２免疫酶試驗

２．１材料準(zhǔn)備

２．１．１試劑

２．１．１．１磷酸鹽緩沖液（ＰＢＳ）：配制見第Ａ．１章。

２．１．１．２抗原涂片的制備：ＰＲＲＳＶ接種于生長至７０％～８０％單層的Ｍａｒｃ１４５細胞。接種后３ｄ～

４ｄ，病變達５０％～７５％時，用胰蛋白酶消化分散感染的細胞單層，ＰＢＳ洗滌三次后，稀釋至１×１０６個細

胞／ｍＬ。取印有１０個～４０個小孔的室玻片，每孔滴加１０μＬ。室溫自然干燥后，冷丙酮（４℃）固定

１０ｍｉｎ。密封包裝，置－２０℃?zhèn)溆谩?/p>

２．１．１．３標(biāo)準(zhǔn)陽性血清：ＰＲＲＳＶ試驗感染豬制備的血清。

２．１．１．４標(biāo)準(zhǔn)陰性血清：無ＰＲＲＳＶ感染、未經(jīng)免疫的豬血清。

２．１．１．５酶結(jié)合物：辣根過氧化物酶（ＨＲＰ）標(biāo)記的葡萄球菌Ａ蛋白（ＳＰＡ）。

２．１．１．６底物溶液：配制見第Ａ．２章。

２．１．２器材

ａ）普通光學(xué)顯微鏡；

ｂ）印有１０個～４０個小孔的室玻片；

ｃ）微量加樣器，容量５μＬ～５０μＬ；

ｄ）３７℃恒溫培養(yǎng)箱或水浴箱。

２．１．３樣品

采集被檢豬血液，分離血清。血清應(yīng)新鮮、透明、不溶血、無污染，密裝于滅菌小瓶內(nèi)，４℃或－３０℃

保存或立即送檢。試驗前將被檢血清統(tǒng)一編號，并用ＰＢＳ作１０倍稀釋。

２．２操作方法

２．２．１取出抗原涂片，室溫干燥后，滴加１０倍稀釋的待檢血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，每份血

清加兩個病毒細胞孔和一個正常細胞孔，置濕盒內(nèi)，３７℃３０ｍｉｎ。

２．２．２ＰＢＳ漂洗三次，每次５ｍｉｎ，室溫干燥。

２．２．３滴加適當(dāng)稀釋的酶結(jié)合物，置濕盒內(nèi)，３７℃３０ｍｉｎ。

２．２．４ＰＢＳ漂洗三次，每次５ｍｉｎ。

２．２．５將室玻片放入底物溶液中，室溫下顯色５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ。ＰＢＳ漂洗兩次，再用蒸餾水漂洗—次。

２．２．６吹干后，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，判定結(jié)果。

２．３結(jié)果判定

２．３．１在陰性血清對照、陽性血清對照成立的情況下：即陰性血清與正常細胞和病毒感染細胞反應(yīng)均

無色；陽性血清與正常細胞反應(yīng)無色，與病毒感染細胞反應(yīng)呈棕黃色至棕褐色，即可判定結(jié)果；否則應(yīng)

重試。

２．３．２待檢血清與正常細胞和病毒感染細胞反應(yīng)均呈無色，即可判為