人體血紅蛋白和血型的測定

實驗（七）前言

血紅蛋白是紅細(xì)胞的主要成分，除作為血液緩沖物質(zhì)而發(fā)揮作用外，其功能是在肺部結(jié)合氧氣，送到全身各組織并將組織中的二氧化碳送到肺部而呼出體外。

血紅蛋白分子是一種由亞鐵血紅素和珠蛋白結(jié)合而成的結(jié)合蛋白，由四個亞基構(gòu)成，分別為兩個α亞基和兩個β亞基。血紅蛋白的貯氧、運氧功能都是依靠血紅素中的Fe2+與O2的配位結(jié)合，血紅蛋白與氧結(jié)合是以協(xié)同效應(yīng)方式進(jìn)行的。

除了運載氧與二氧化碳，血紅蛋白還可以一氧化碳、氰離子結(jié)合，結(jié)合的方式也與氧完全一樣，所不同的只是結(jié)合的牢固程度，一氧化碳、氰離子一旦和血紅蛋白結(jié)合就很難離開，這就是煤氣中毒和氰化物中毒的原理。

實驗?zāi)康?.掌握722分光光度計的原理及操作方法；2.了解比色法測定的原理；3.掌握氰化高鐵血紅蛋白法的原理；4.熟悉移液管的使用及末梢采血的方法；5.掌握血紅蛋白指標(biāo)測定的意義及在運動實踐中的應(yīng)用。722分光光度計的原理

光是一種電磁波，白光是由不同波長（400～760nm）的電磁波按一定比例組成的混合光，通過棱鏡可分解成紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等各種顏色相連續(xù)的可見光譜。在白光的照射下，物體所以呈現(xiàn)特定的顏色，是因為物體對不同波長的光有選擇性地吸收所致。不同物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同，對不同波長的光線的吸收能力也不同，因此，每種物質(zhì)都具有其特異的吸收光譜。

T=I/I0

其中：T

透過率

I0

入射光強(qiáng)度

I

透射光強(qiáng)度

A

吸光度

K

吸收系數(shù)

L

溶液的光徑長度

C

溶液的濃度分光光度分析技術(shù)的原理

綠黃青

橙白青藍(lán)紅藍(lán)紫

上圖對應(yīng)的兩邊互為互補(bǔ)光，如將互補(bǔ)的色光相混即產(chǎn)生白光。

1.分光光度法是利用物質(zhì)特有的吸收光譜來鑒定物質(zhì)及其含量的方法。

2.光投射到物體上可被物體吸收或反射，如該物體是透明的則還有部分光可以透過。在白光照射下，物體所呈現(xiàn)特定的顏色，就是物體對不同波長的光有選擇性的吸收所致。而溶液對某些波長的光的吸收極少而對其他波長的光吸收較多,則溶液就呈現(xiàn)這種吸收較少且透過較多光的顏色(如：硫酸銅溶液對黃光吸收最強(qiáng)，對藍(lán)光吸收最弱，故在白光的照射下該溶液呈現(xiàn)____)

，說明任何有色溶液(或物體)都只對一種單色光有強(qiáng)烈的吸收能力,而對其它波長的光吸收能力較弱。

(一)人體血紅蛋白的測定

實驗原理

Hb被高鐵氰化鉀氧化成高鐵血紅蛋白(Hi)，Hi與氰離子結(jié)合成氰化高鐵血紅蛋白(HiCN)，它在540nm有一吸收峰，測其光密度而得Hb的濃度。

Hb+K3Fe(CN)б

氧化

Hi

Hi+CN

合成HiCN

實驗試劑和儀器

試劑：

(1)HiCN稀釋液（有毒）

（注：高鐵氰化鉀法測定血紅蛋白比較準(zhǔn)確、穩(wěn)定，是目前國家承認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，但試劑中有氰化物，劇毒，在實驗進(jìn)行過程中避免污染，實驗完畢后注意藥品的處理，不能亂倒）

(2)75%的酒精

儀器：

722分光光度計、半自動生化分析儀、一次性采血裝置、一次性采血管（20微升）、消毒棉球、5毫升試管、移液管

測定管（一次性試管）氰化高鐵血紅蛋白稀釋液5ml酒精消毒手指，并采取新鮮血液20μl

混勻后放置至少10分鐘540nm比色,空白調(diào)零讀取測定管光密度值實驗操作步驟

1

2

3

4

5

6

7

8

1光源2聚光透鏡3色散棱鏡4狹縫

5比色杯6光門7光電管8檢流計722分光光度計結(jié)構(gòu)示意圖

722分光光度計的使用（1）開啟電源，指示燈亮，儀器預(yù)熱20分鐘，選擇開關(guān)置于“T”檔（2）旋動波長手輪，將測試所需540nm波長調(diào)節(jié)至刻度線處。（3）打開樣品室蓋，調(diào)節(jié)“0%T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“0.00”。（4）以稀釋液（不含待測物質(zhì)的反應(yīng)液）作為空白，蓋上樣品室蓋，調(diào)節(jié)透過率“100%T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“100.0”,然后將選擇開關(guān)置于“A”檔，用稀釋液調(diào)消光零。（5）移入待測溶液，顯示值即為樣品的吸光度A值。電源開關(guān)選擇開關(guān)722型分光光度計波長手輪0%T”旋鈕100%T”旋鈕比色杯（皿）樣品室采血時，采血針應(yīng)一人一針，嚴(yán)防交叉感染。第一滴血棄去不用（為什么？）3.毛細(xì)吸管吸血時，避免氣泡吸入。否則會使測定結(jié)果偏低。若有氣泡產(chǎn)生，請使用干棉簽吸之。4.采血時，動作應(yīng)迅速，否則易發(fā)生凝血現(xiàn)象。5.

配制好的HiCN稀釋液中因氰化鉀含量低，毒性不是很大，但仍應(yīng)妥善保管。測定后的廢液不能與酸性溶液混合，因為氰化鉀遇酸可產(chǎn)生劇毒的氰氫酸氣體。為防止氰化鉀污染環(huán)境，比色測定后的廢液集中于廣口瓶中，可用除毒液除毒。

[注意事項]

Hb在運動實踐中的應(yīng)用：

Hb指標(biāo)主要用于評定某個訓(xùn)練周期或階段，如根據(jù)1-2周時間內(nèi)運動員對運動量和運動強(qiáng)度的反應(yīng)來評定運動員的機(jī)能狀態(tài)等。Hb在運動訓(xùn)練中的變化是多因素綜合作用的結(jié)果，如僅從運動負(fù)荷的影響看，大運動量訓(xùn)練期間系統(tǒng)測試血紅蛋白，可能會出現(xiàn)以下三種類型：

（1）訓(xùn)練初Hb下降，經(jīng)一段訓(xùn)練后，Hb又逐步回升。

（2）訓(xùn)練初Hb下降，經(jīng)一段訓(xùn)練后，始終未出現(xiàn)回升。

（3）訓(xùn)練期間，

Hb無顯著變化。

（1）表示運動量安排適宜；（2）、（3）則分別由于運動量過大，過小而未能出現(xiàn)血紅蛋白的正常變化趨勢。因此，測試Hb的含量，對于評定運動員的機(jī)能狀態(tài)和運動訓(xùn)練水平等具有重要的意義。

（二）ABO血型的鑒定

血型的概念：是指血細(xì)胞上特異凝集原的類型。

ABO血型的分類依據(jù)血型紅細(xì)胞上的凝集原血清中的凝集素AA抗BBB抗AABA、B無O無抗A、抗B備注：紅細(xì)胞表面上含凝集原，血清中含凝集素（一）實驗?zāi)康脑恚?/p>

通過用標(biāo)準(zhǔn)血型抗體對紅細(xì)胞膜上ABO系統(tǒng)血型抗原的鑒定，掌握ABO系統(tǒng)定型的基本操作方法，判讀技能。

根據(jù)lgM類特異性血型抗體與紅細(xì)胞上特異性抗原結(jié)合能夠出現(xiàn)凝集反應(yīng)的原理。

即：凝集原與其相對應(yīng)的凝集素相遇時將會發(fā)生凝集反應(yīng)

例如：凝集原A+抗A凝集反應(yīng)（二）實驗器材：采血器具、玻片、玻棒、抗A抗B血型定型試劑（三）實驗步驟：（玻片法）1.在白紙上分別注明“抗A”“抗B”字樣，并放上玻片，分別滴1~2滴血型定型劑；2