動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)01動(dòng)物細(xì)胞工程常用的技術(shù)包括動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物細(xì)胞融合和細(xì)胞核移植等，其中動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是動(dòng)物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)。（教材P43）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是從動(dòng)物體中取出相關(guān)的組織或器官,將它分散成單個(gè)細(xì)胞，然后在適宜的培養(yǎng)條件下,讓這些細(xì)胞生長和增殖的技術(shù)。(教材P43)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)所需的基本條件其他條件營養(yǎng)條件糖類、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素?zé)o菌、無毒的環(huán)境適宜的溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環(huán)境動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是對體內(nèi)細(xì)胞生長和繁殖的模擬動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)01營養(yǎng)條件

將細(xì)胞所需的上述營養(yǎng)物質(zhì)按其種類和所需數(shù)量嚴(yán)格配制而成的培養(yǎng)基，稱為合成培養(yǎng)基(區(qū)別天然培養(yǎng)基)。培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞一般使用液體培養(yǎng)基,也叫培養(yǎng)液.☆由于人們對細(xì)胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)還沒有完全搞清楚，因此，在使用合成培養(yǎng)基時(shí)，通常需加入血清和血漿等一些天然成分。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)所需的基本條件其他條件營養(yǎng)條件糖類、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素?zé)o菌、無毒的環(huán)境適宜的溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環(huán)境無菌、無毒的環(huán)境無菌：無菌操作—防止培養(yǎng)過程中的微生物污染無毒：定期更換培養(yǎng)液—清除代謝產(chǎn)物，防止代謝產(chǎn)物積累對細(xì)胞造成危害。溫度、pH和滲透壓氣體環(huán)境溫度：36.5±0.5℃pH：7.2-7.4滲透壓：維持細(xì)胞正常形態(tài)O2：細(xì)胞代謝所必須CO2：維持培養(yǎng)液的pH值用培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶，在95%空氣和5%CO2的混合氣體的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)01動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過程02動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過程02細(xì)胞接觸抑制細(xì)胞貼壁懸液中大多數(shù)分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上生長增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞貼壁。當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為接觸抑制。腫瘤細(xì)胞失去接觸抑制，在培養(yǎng)液可以無限增殖下去。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過程02機(jī)械方法胰蛋白酶處理膠原蛋白酶處理動(dòng)物組織塊分散成單個(gè)細(xì)胞加培養(yǎng)液細(xì)胞懸液放入培養(yǎng)瓶在適宜條件在適宜條件分瓶培養(yǎng)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)將分瓶之前的細(xì)胞培養(yǎng)，即動(dòng)物組織經(jīng)過處理后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。將分瓶后的細(xì)胞培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)★體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞分為兩類①懸浮生長細(xì)胞：細(xì)胞能夠懸浮在培養(yǎng)液中生長增殖②貼壁生長細(xì)胞：細(xì)胞需要貼附于某些基質(zhì)(如培養(yǎng)瓶壁)表面才能增殖(主要類型)細(xì)胞株與細(xì)胞系拓展①細(xì)胞株:傳代培養(yǎng)的細(xì)胞能傳到10~50代,這樣的傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞株。②細(xì)胞系:傳代培養(yǎng)的細(xì)胞在傳到50代后,部分細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變,并且具有癌變的特點(diǎn),能夠無限地傳代下去,這樣的傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞系?！餅槭裁匆M(jìn)行分瓶培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過程02細(xì)胞系的生命期機(jī)體中能進(jìn)行自我更新（產(chǎn)生與自身相同的子代細(xì)胞）并具有多向分化潛能（分化形成不同細(xì)胞類型）的一類細(xì)胞稱為干細(xì)胞。干細(xì)胞基本特征干細(xì)胞能產(chǎn)生與自己相同的子代細(xì)胞，即自我更新能力。同時(shí)也具有分化成不同細(xì)胞類型的潛能干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用03①胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)：存在于早期胚胎中，具有分化為成年動(dòng)物體內(nèi)的任何一種類型的細(xì)胞，并進(jìn)一步形成機(jī)體的所有組織和器官甚至個(gè)體的潛能?！锓诸悾禾攸c(diǎn)：體積小、細(xì)胞核大、核仁明顯。取自早期胚胎。也叫做全能干細(xì)胞。②成體干細(xì)胞：存在于成體組織或器官內(nèi)中，包括骨髓中的造血干細(xì)胞，神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)干細(xì)胞和睪丸中的精原干細(xì)胞成體干細(xì)胞具有組織特性，一般只能分化成特定的細(xì)胞或組織，不具有發(fā)育成完整個(gè)體的能力。應(yīng)用再生醫(yī)學(xué)運(yùn)用克隆技術(shù)獲得患者“自身”的胚胎干細(xì)胞，然后在合適的條件下，定向分化成患者所需的各種細(xì)胞類型，如胰島細(xì)胞可用于移植和糖尿病的治療將治療性克隆技術(shù)與人胚胎干細(xì)胞的制備相結(jié)合，利用體外構(gòu)建的自身組織與器官來使患者得以康復(fù)。胚胎干細(xì)胞或卵細(xì)胞的來源？干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用03應(yīng)用再生醫(yī)學(xué)日本京都大學(xué)教授山中伸彌在2006年，選取了24個(gè)對胚胎干細(xì)胞維持十分重要的基因，在小鼠的成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，最后發(fā)現(xiàn)同時(shí)轉(zhuǎn)入4種基因（Oct4、Sox2、c-myc

和KLF4）就可誘導(dǎo)產(chǎn)生一種多能干細(xì)胞，稱“誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞”（iPScell）干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用03應(yīng)用誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞iPS技術(shù)是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破，它回避了歷來已久的倫理爭議，解決了干細(xì)胞移植醫(yī)學(xué)上的免疫排斥問題，利用iPS細(xì)胞治療小鼠鐮狀細(xì)胞貧血*注意：從小鼠體內(nèi)獲得的成纖維細(xì)胞會含有鐮狀細(xì)胞平血基因，在誘導(dǎo)形成iPS細(xì)胞的過程中，需要對致病基因進(jìn)行修復(fù)。干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用03應(yīng)用誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的制備取出病人移植轉(zhuǎn)入相關(guān)因子，細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞iPS細(xì)胞分化各種類型的細(xì)胞干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用03干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用03例1.為初步檢測藥物X和Y的抗癌活性,在細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入相同數(shù)量的肝癌細(xì)胞,使其貼壁生長,實(shí)驗(yàn)組加入等體積相同濃度的溶于二甲基亞砜(溶劑)的藥物X或Y,培養(yǎng)過程及結(jié)果如下圖所示。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（

）A.細(xì)胞培養(yǎng)液中通常需要加入血清B.可用胰蛋白酶處理使肝癌細(xì)胞脫落下來并進(jìn)行計(jì)數(shù)C.對照組中應(yīng)加入等體積的無菌蒸餾水D.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以初步判斷藥物X的抗癌效果較好例2.下列有關(guān)干細(xì)胞的敘述，錯(cuò)誤的是()A.干細(xì)胞是具有分裂和分化能力的細(xì)胞B.造血干細(xì)胞可定向誘導(dǎo)分化成機(jī)體所有種類的細(xì)胞C.胚胎干細(xì)胞在飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)能夠維持不分化的狀態(tài)D.移植胚胎干細(xì)胞可使退化的組織得以修復(fù)并恢復(fù)正常功能CB動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)04動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)就是使兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。融合后形成的雜交細(xì)胞就有原來兩個(gè)細(xì)胞的遺傳遺傳信息。(教材P48)方法物理方法：電融合法、離心法化學(xué)方法：聚乙二醇（PEG）法與植物原生質(zhì)體融合的基本原理相同生物方法：滅活病毒誘導(dǎo)法肺結(jié)核病病人體內(nèi)病毒等誘導(dǎo)多個(gè)體細(xì)胞融合形成了多核細(xì)胞。方法生物方法：滅活病毒誘導(dǎo)法滅活：是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)。原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞相互凝集，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。(P48相關(guān)信息)動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)04意義①突破有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能②研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。③利用動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)而發(fā)展起來的雜交瘤技術(shù)，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。

種間、屬間、科間，甚至動(dòng)物和植物之間的細(xì)胞融合都已獲得成功。動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)04傳統(tǒng)抗體的生產(chǎn)方法向動(dòng)物反復(fù)注射某種抗原使動(dòng)物產(chǎn)生抗體從動(dòng)物血清中分離所需抗體產(chǎn)量低、純度低、特異性差單克隆抗體及其應(yīng)用05動(dòng)物會接觸多種天然抗原，體內(nèi)相應(yīng)產(chǎn)生的特異性抗體種類可以達(dá)到百萬種以上，但每一個(gè)淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。因此，要想獲得大量的單一抗體，必須克隆單一的淋巴細(xì)胞，形成細(xì)胞群。(教材P49)單克隆抗體及其應(yīng)用☆抗體一個(gè)B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞群單克隆抗體克隆產(chǎn)生×B淋巴細(xì)胞不具有無限增殖的能力1975年，英國科學(xué)家米爾斯坦和德國科學(xué)家科勒設(shè)計(jì)了一個(gè)極富創(chuàng)造性的試驗(yàn)方案：解決B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞抗體05單克隆抗體及其應(yīng)用米爾斯坦和科勒制備單克隆抗體過程示意圖05單克隆抗體及其應(yīng)用米爾斯坦和科勒制備單克隆抗體過程示意圖05單克隆抗體及其應(yīng)用05單克隆抗體及其應(yīng)用單克隆抗體的應(yīng)用①作為診斷試劑診斷疾病05②運(yùn)載藥物治療疾?、圩鳛樗幬镏委熂膊慰寺】贵w及其應(yīng)用05例3.人乳頭瘤病毒(HPV)是一種DNA病毒,可誘發(fā)細(xì)胞癌變?？笻PV的單克隆抗體可以準(zhǔn)確檢測出HPV,從而及時(shí)監(jiān)控宮頸癌的發(fā)生。以HPV衣殼蛋白為抗原制備出單克隆抗體的過程如圖所示。下列錯(cuò)誤的是(

)A.在HAT培養(yǎng)基上存活的雜交瘤細(xì)胞既能無限增殖又可分泌抗體DB.單克隆抗體的特點(diǎn)是靈敏度高、特異性強(qiáng)，可以大量制備C.可用HPV衣殼蛋白檢測篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞D.單克隆抗體制備過程涉及的生物學(xué)原理有細(xì)胞增殖和細(xì)胞膜的選擇透過性例4.一個(gè)抗原往往有多個(gè)不同的抗原決定簇，一個(gè)抗原決定簇只能刺激機(jī)體產(chǎn)生一種抗體，由同一抗原刺激產(chǎn)生的不同抗體統(tǒng)稱為多抗。將非洲豬瘟病毒衣殼蛋白p72注入小鼠體內(nèi)，可利用該小鼠的免疫細(xì)胞制備抗p72的單抗，也可以從該小鼠的血清中直接分離出多抗。下列說法正確的是()A.注入小鼠體內(nèi)的抗原純度對單抗純度的影響比對多抗純度的影響大B.單抗制備過程中通常將分離出的漿細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合C.利用該小鼠只能制備出一種抗p72的單抗D.p72部分結(jié)構(gòu)改變后會出現(xiàn)原單抗失效而多抗仍有效的情況D將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核，移入去核的卵母細(xì)胞中，使這個(gè)重新組合的細(xì)胞發(fā)育成新胚胎，繼而發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)。(教材P52黑體字)胚胎細(xì)胞體細(xì)胞原理：動(dòng)物體細(xì)胞核的全能性胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易細(xì)胞分化程度高，恢復(fù)全能性十分困難克隆動(dòng)物供體一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核受體去掉核的卵母細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞核移植技術(shù)06①收集牛卵巢，采集卵母細(xì)胞②通過顯微操作去核③從供體高產(chǎn)奶牛身體的某一部分取體細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)供體高產(chǎn)奶牛④將供體細(xì)胞注入去核的卵母細(xì)胞⑤通過電融合法使兩細(xì)胞融合，供體核進(jìn)入卵母細(xì)胞形成重構(gòu)胚⑥將胚胎移入受體(代孕)母牛體內(nèi)⑦生出與供體奶牛遺傳物質(zhì)相同的犢牛動(dòng)物細(xì)胞核移植技術(shù)06動(dòng)物體細(xì)胞核移植屬于無性生殖體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景及存在的問題畜牧業(yè)加速家畜遺傳改良進(jìn)程、促進(jìn)改良畜群繁育動(dòng)物細(xì)胞核移植技術(shù)06醫(yī)藥衛(wèi)生克隆動(dòng)物（也經(jīng)過轉(zhuǎn)基因操作）的細(xì)胞、組織、器官可作為異種移植的供體科研保護(hù)瀕危物種問題①成功率低②克隆動(dòng)物存在健康問題③克隆動(dòng)物食品的安全性問題存在爭議動(dòng)物細(xì)胞核移植技術(shù)06例5.2018年1月國際頂尖學(xué)術(shù)期刊《Cell》雜志報(bào)道，我國科學(xué)家以一只雌性獼猴胎兒成纖維細(xì)胞為核供體成功克隆兩只獼猴，成為全球首例體細(xì)胞克隆靈長類動(dòng)物。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）A.這項(xiàng)技術(shù)證明高度分化的動(dòng)物體細(xì)胞具有全能性B.研究中需要使用成熟卵母細(xì)胞作為核移植的受體C.培育出的兩只雌性獼猴的基因組成