轉(zhuǎn)化率的計算（一）轉(zhuǎn)化（transformation）（1）熱激法（heatshock）（2）電轉(zhuǎn)化法（electronporation）（3）PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（4）接合轉(zhuǎn)化一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法

1、化學轉(zhuǎn)化法感受態(tài)：細菌能從周圍環(huán)境中吸收DNA的生理狀態(tài)稱為感受態(tài)(competence).

感受態(tài)的出現(xiàn)是由于細菌表面出現(xiàn)許多DNA結(jié)合位點，這些位點只能與雙鏈DNA結(jié)合，而不與單鏈DNA結(jié)合。

這說明完整的雙鏈結(jié)構(gòu)對于轉(zhuǎn)化活性來說是必要的。對于大腸桿菌細胞，一般采用CaCl2溶液來處理受體細胞，增加細胞膜的通透性，制備感受態(tài)細胞。一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法細菌感受態(tài)細胞的制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重懸一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法重組體導(dǎo)入受體細胞10ng載體DNA100L感受態(tài)菌

Onice混合，靜置30分鐘37℃搖1小時10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA加入1mLLB培養(yǎng)基42oC1.5分鐘熱休克法簡單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/gDNA）。一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37℃過夜一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法

2.電擊轉(zhuǎn)化法

將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。

在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進入細胞內(nèi)

原理:

用高壓脈沖電流擊破細胞膜或擊成小孔，使各種大分子(包括DNA)通過這些小孔進入細胞.轉(zhuǎn)化效率高（高于109/gDNA）一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2℃離心集菌冰冷的水重懸菌體2℃離心集菌冰冷的水重懸菌體2℃離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成

50-300L電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F脈沖控制器200-400

0.5g質(zhì)粒DNAOnice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37℃中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化電擊轉(zhuǎn)化法（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)由噬菌體和細胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息的轉(zhuǎn)移過程（三）轉(zhuǎn)染噬菌體DNA不經(jīng)過蛋白包裝成病毒顆粒，直接被感受態(tài)細胞捕獲的過程。與轉(zhuǎn)化無本質(zhì)區(qū)別體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，形成噬菌斑。每gDNA能形成106個噬菌斑

現(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動物細胞的過程也稱轉(zhuǎn)染

體外包裝過程二、重組DNA導(dǎo)入真核細胞（一）導(dǎo)入酵母細胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化堿金屬離子介導(dǎo)的完整細胞轉(zhuǎn)化PEG1000轉(zhuǎn)化法電擊法（二）導(dǎo)入植物細胞（三）導(dǎo)入動物細胞1.利用原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2

PEG插入外源基因的載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化細胞達原生質(zhì)體總數(shù)的1%~2%，轉(zhuǎn)化率受再生率影響共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25%~33%

酵母0.1mol/LLiCl處理感受態(tài)2.堿金屬離子介導(dǎo)的完整細胞轉(zhuǎn)化插入外源基因的載體40%PEG4000熱激涂布選擇性平板，篩選轉(zhuǎn)化子

吸收線性DNA能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍轉(zhuǎn)化率：103個

/gDNA；共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極少4.電擊轉(zhuǎn)化（1）適于原生質(zhì)體和完整細胞（2）轉(zhuǎn)化率高，105個/gDNA（3）單鏈轉(zhuǎn)化率高于雙鏈3.PEG1000轉(zhuǎn)化PEG處理酵母細胞，可獲得類感受態(tài)，用于轉(zhuǎn)化二、重組DNA導(dǎo)入真核細胞（一）導(dǎo)入酵母細胞載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（農(nóng)桿菌介導(dǎo)）DNA直接導(dǎo)入（基因搶法、電擊法等）種質(zhì)系統(tǒng)法（花粉管通道法等）（二）導(dǎo)入植物細胞（三）導(dǎo)入動物細胞（二）導(dǎo)入植物細胞1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法將目的基因插入到載體的T-DNA區(qū)，形成重組DNA（二）導(dǎo)入植物細胞1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法將重組DNA轉(zhuǎn)入含有Vir致病基因的農(nóng)桿菌（二）導(dǎo)入植物細胞1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法通過農(nóng)桿菌侵染植物外植體（二）導(dǎo)入植物細胞1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法將含有外源目的基因的T-DNA整合到植物細胞基因組中，獲得轉(zhuǎn)基因植株在飼養(yǎng)平皿的濾紙上培養(yǎng)2天葉盤法的具體操作又稱生物彈擊法、微彈轟擊法，借助高速金屬微粒將DNA分子引入活細胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)。DNA1.2m鎢彈頭吸附金屬微粒加速，進入受體細胞基因槍裝入2.基因槍法（genegun）

外植體制備轟擊外植體培養(yǎng)及選擇基因槍具體操作1.DNA微彈的制備2.外植體的制備3.DNA微彈轟擊4.外植體的培養(yǎng)植物細胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液電擊處理愈傷組織幼苗分化3.電擊法（電穿孔法）選擇培養(yǎng)二、重組DNA導(dǎo)入真核細胞（一）導(dǎo)入酵母細胞1.磷酸鈣沉淀法2.脂質(zhì)體介導(dǎo)法3.顯微注射法4.DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法（二）導(dǎo)入植物細胞（三）導(dǎo)入動物細胞原理：（三）導(dǎo)入動物細胞1.磷酸鈣沉淀法通過磷酸鈣-DNA共沉淀，將外源基因?qū)氩溉閯游锛毎罁?jù)不同的細胞類型，平皿上最多能有10%的細胞能吸收DNA沉淀。操作簡便，成本低廉、可大批量轉(zhuǎn)染、對細胞毒性小、效果穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)染效率低。2.脂質(zhì)體介導(dǎo)法脂質(zhì)體包埋DNA，通過細胞膜進入細胞。脂質(zhì)體（lipofectin）載體法應(yīng)用玻璃顯微注射器，直接把外源DNA注射到宿主細胞核里，使其整合到染色體上。3.顯微注射法1）外源基因制備：線性化的質(zhì)?；蚰康钠?）收集受精卵：受孕后幾小時內(nèi)3）顯微注射：將外源基因注入受精卵的雄原核4）受精卵移植顯微注射法(microinjection)二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖為多聚陽離子試劑，能促進哺乳動物細胞攝入外源DNA。4.DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法葡聚糖葡聚糖DEAE-dextran外源DNA細胞混合DEAE-dextran對細胞有毒，常采用低濃度長時間處理吸附到細胞表面后被細胞吞入，部分DNA可以進入到細胞核里。4.DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入外源DNA的幾種方法三、轉(zhuǎn)化率及影響因素轉(zhuǎn)化率（cfu

/μgDNA）：每微克重組DNA轉(zhuǎn)化后，接納DNA分子的受體細胞的個數(shù)，即陽性克隆數(shù)。（一）轉(zhuǎn)化率的計算：轉(zhuǎn)化率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/DNA的加入量三、轉(zhuǎn)化率及影響因素例：取1μl（0.1ng/μl）完整的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化100μl的感受態(tài)細胞。向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中加入900μl培養(yǎng)液，讓細菌恢復(fù)一小段時間，取100μl鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個菌落，轉(zhuǎn)化率為多少？轉(zhuǎn)化率＝1000

/0.01ngDNA=108cfu/μg三、轉(zhuǎn)化率及影響因素例：某一DNA重組實驗的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107cfu/mg天然載體，經(jīng)酶切和連接處理后的重組載體轉(zhuǎn)化率比天然載體約低100倍，欲獲得104個重組克隆，需要投入多少重組載體DNA進行重組實驗？104＝107cfu/mg×10-2×a×20%重組載體a=0.5mg三、轉(zhuǎn)化率及影響因素普通的亞克隆實驗：1×106cfu/μgDNA；更復(fù)雜的亞克隆：1×107cfu/μgDNA，如有限量的DNA的轉(zhuǎn)化，T-A克??；構(gòu)建文庫：>1×108cfu/μgDNA。1）載體DNA類型、大??；重組DNA濃度、純度2）受體細胞3）轉(zhuǎn)化方法：同一轉(zhuǎn)化方法技術(shù)參數(shù)影響轉(zhuǎn)化率（二）轉(zhuǎn)化率的影響因素三、轉(zhuǎn)化率及影響因素

影響轉(zhuǎn)化率的因素

（2）感受態(tài)細胞（competen