乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)及其正負(fù)調(diào)控天津商業(yè)大學(xué)生物工程類(lèi)1002班帖航2/6/20231一.乳糖操縱子的提出

大腸桿菌可以利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖等作為碳源而生長(zhǎng)繁殖，當(dāng)培養(yǎng)基中含有葡萄糖和乳糖時(shí)，細(xì)菌優(yōu)先利用葡萄糖，當(dāng)葡萄糖耗盡，細(xì)菌停止生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)短時(shí)間的適應(yīng)，就能利用乳糖，細(xì)菌繼續(xù)呈指數(shù)式繁殖增長(zhǎng)。葡萄糖效應(yīng)（葡萄糖阻遏或分解代謝物阻遏作用），大腸桿菌的2次生長(zhǎng)。2/6/20232這種典型的誘導(dǎo)現(xiàn)象，是研究基因表達(dá)調(diào)控極好的模型。針對(duì)大腸桿菌利用乳糖的適應(yīng)現(xiàn)象，法國(guó)的Jocob和Monod等人做了一系列遺傳學(xué)和生化學(xué)研究實(shí)驗(yàn)，于1961年提出乳糖操縱子（lac

operon）學(xué)說(shuō)，在1965諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)。Fran?oisJacob

JacquesMonod

2/6/20233二、乳糖操縱子的基本組成

乳糖操縱子：核酸分子上調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性的基本單元，由調(diào)節(jié)基因、啟動(dòng)子（P）、操作區(qū)（O）、結(jié)構(gòu)基因、和終止子和組成。2/6/20234結(jié)構(gòu)基因群

操縱子中被調(diào)控的編碼蛋白質(zhì)的基因稱(chēng)為結(jié)構(gòu)基因(structuralgene,SG)。每個(gè)結(jié)構(gòu)基因是一個(gè)連續(xù)的開(kāi)放閱讀框(openreadingframe),5’端有起始密碼ATG，3’端有終止密碼TAA、TGA或TAG。

Z基因5’側(cè)具有大腸桿菌核糖體識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)（RBS）特征的Shine-Dalgarno(SD)序列。由于ｚ、ｙ、ａ三個(gè)基因頭尾相接，因而同一個(gè)核糖體能沿此轉(zhuǎn)錄生成的多順?lè)醋樱╬olycistron）mRNA移動(dòng)，一氣依次合成這基因群所編碼所有的蛋白質(zhì)。2/6/20235ｚ基因長(zhǎng)3510bp，編碼含1170個(gè)氨基酸、分子量為135,000的多肽，以四聚體形式組成有活性的β-半乳糖苷酶，催化乳糖轉(zhuǎn)變?yōu)閯e乳糖(allolactose)，再分解為半乳糖和葡萄糖；ｙ基因長(zhǎng)780bp，編碼有260個(gè)氨基酸、分子量為30,000的半乳糖透過(guò)酶，促使環(huán)境中的乳糖進(jìn)入細(xì)菌；

ａ基因長(zhǎng)825bp，編碼275氨基酸、分子量為32,000的轉(zhuǎn)乙?；福远垠w活性形式催化半乳糖的乙?；?。

2/6/20236啟動(dòng)子

啟動(dòng)子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。操縱子至少有一個(gè)啟動(dòng)子，一般在第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因5＇側(cè)上游，控制整個(gè)結(jié)構(gòu)基因群的轉(zhuǎn)錄。

2/6/20237操縱區(qū)

操縱區(qū)（operator）是指能被調(diào)控蛋白特異性結(jié)合的一段DNA序列，當(dāng)調(diào)控蛋白結(jié)合在操縱子序列上，會(huì)影響其下游基因轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)弱。Promotor:-84---+1Operator:-7---+28兩者有7bp重疊，使這段序列可能無(wú)法同時(shí)結(jié)合RNA聚合酶和阻遏蛋白，也可能雖然可以同時(shí)結(jié)合，但無(wú)法形成開(kāi)放的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物2/6/20238調(diào)控基因

調(diào)控基因(regulatorygene)是編碼能與操縱序列結(jié)合的調(diào)控蛋白的基因。調(diào)控蛋白有：阻遏蛋白(repressiveprotein)：與操縱區(qū)結(jié)合后能減弱或阻止其調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄，其介導(dǎo)的調(diào)控方式為負(fù)調(diào)控(negativeregulation),

；

激活蛋白(activatingprotein)（或無(wú)輔基誘導(dǎo)蛋白（apoinducer)

）：與操縱區(qū)結(jié)合后能增強(qiáng)或起動(dòng)其調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄，所介導(dǎo)的調(diào)控方式為正調(diào)控(positiveregulation)。乳糖操縱子中，調(diào)控基因lacI位于Plac鄰近，有其自身的啟動(dòng)子和終止子，轉(zhuǎn)錄方向和結(jié)構(gòu)基因群的轉(zhuǎn)錄方向一致，編碼產(chǎn)生由347個(gè)氨基酸組成的阻遏蛋白R(shí)。2/6/20239終止子

終止子（terminator，T）是給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列。在一個(gè)操縱子中至少在結(jié)構(gòu)基因群最后一個(gè)基因的后面有一個(gè)終止子。2/6/202310

終止子都在結(jié)構(gòu)基因的附近，只能對(duì)同一條DNA鏈上的基因表達(dá)起調(diào)控作用，這種作用在遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)上稱(chēng)為順式作用（cis-action），啟動(dòng)子、操縱子和終止子就屬于順式作用元件（cis-actingelement）。調(diào)控基因可以在結(jié)構(gòu)基因群附近、也可以遠(yuǎn)離結(jié)構(gòu)基因，它是通過(guò)其基因產(chǎn)物──調(diào)控蛋白來(lái)發(fā)揮作用的，因而調(diào)控基因不僅能對(duì)同一條DNA鏈上的結(jié)構(gòu)基因起表達(dá)調(diào)控作用，而且能對(duì)不在一條DNA鏈上的結(jié)構(gòu)基因起作用，在遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)上稱(chēng)為反式作用（trans-action），調(diào)控基因就屬于反式作用元件（trans-actingelement），其編碼產(chǎn)生的調(diào)控蛋白稱(chēng)為反式調(diào)控因子（trans-actingfactor）。由此也可窺測(cè)到基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理的關(guān)鍵在蛋白質(zhì)與核酸的相互作用上。2/6/202311二、乳糖操縱子的表達(dá)調(diào)控

阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控CAP的正調(diào)控2/6/2023121.阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控

當(dāng)大腸桿菌在沒(méi)有乳糖的環(huán)境中生存時(shí)，lac操縱子處于阻遏狀態(tài)。此ｉ基因在其自身的啟動(dòng)子Pi控制下，低水平、組成性表達(dá)產(chǎn)生阻遏蛋白R(shí)，每個(gè)細(xì)胞中僅維持約10個(gè)分子的阻遏蛋白。R以四聚體形式與操縱子ｏ結(jié)合，阻礙了RNA聚合酶與啟動(dòng)子Plac的結(jié)合，阻止了基因的轉(zhuǎn)錄起動(dòng)。R的阻遏作用不是絕對(duì)的，R與ｏ偶爾解離，使細(xì)胞中還有極低水平的－半乳糖苷酶及透過(guò)酶的生成。PstructuralgenesOlacZ

lacY

lacAIR2/6/202313當(dāng)有乳糖存在時(shí)，乳糖受－半乳糖苷酶的催化轉(zhuǎn)變?yōu)閯e乳糖，與R結(jié)合，使R構(gòu)象變化，R四聚體解聚成單體，失去與ｏ的親和力，與ｏ解離，基因轉(zhuǎn)錄開(kāi)放，使－半乳糖苷酶在細(xì)胞內(nèi)的含量可增加1000倍。這就是乳糖對(duì)lac操縱子的誘導(dǎo)作用。

β-半乳糖苷酶β-半乳糖苷通透酶β-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶lacZ

lacY

lacA別乳糖等誘導(dǎo)物IPOR2/6/2023142.CAP的正調(diào)控

細(xì)菌中的cAMP（環(huán)化腺苷酸）含量與葡萄糖的分解代謝有關(guān)，當(dāng)細(xì)菌利用葡萄糖分解產(chǎn)生能量時(shí)，cAMP生成少而分解多；相反，當(dāng)環(huán)境中無(wú)葡萄糖可供利用時(shí)，cAMP含量就升高。細(xì)菌中有一種能與cAMP特異結(jié)合的cAMP受體蛋白CRP(cAMPreceptorprotein)，當(dāng)CRP未與cAMP結(jié)合時(shí)它是沒(méi)有活性的，當(dāng)cAMP濃度升高時(shí)，CRP與cAMP結(jié)合并發(fā)生空間構(gòu)象的變化而活化，稱(chēng)為CAP(CRP-cAMPactivatedprotein)(分解代謝基因激活蛋白)，能以二聚體的方式與特定的DNA序列結(jié)合。

CAP結(jié)合位點(diǎn)（CAPbindingsite）在lac操縱子的啟動(dòng)子Plac上游端，當(dāng)CAP與這段序列結(jié)合時(shí)，可增強(qiáng)RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性，使轉(zhuǎn)錄提高50倍。相反，當(dāng)有葡萄糖可供分解利用時(shí)，cAMP濃度降低，CRP不能被活化，lac操縱子的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)下降。2/6/2023152/6/202316由此可見(jiàn)，正調(diào)控與負(fù)調(diào)控并非互相排斥的兩種機(jī)制，而是生物體為適應(yīng)環(huán)境而進(jìn)行的一種協(xié)同機(jī)制。

Plac是弱啟動(dòng)子，單純因乳糖的存在發(fā)生去阻遏使lac操縱子轉(zhuǎn)錄開(kāi)放，還不能使細(xì)菌很好利用乳糖，必需同時(shí)有CAP來(lái)加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，細(xì)菌才能合成足夠的酶來(lái)利用乳糖。lac操縱子的強(qiáng)誘導(dǎo)既需要有乳糖的存在又需要沒(méi)有葡萄糖可供利用。通過(guò)這機(jī)制，細(xì)菌是優(yōu)先利用環(huán)境中的葡萄糖，只有無(wú)葡萄糖而又有乳糖時(shí)，細(xì)菌才去充分利用乳糖。2/6/202317無(wú)葡萄糖cAMP濃度高mRNA無(wú)乳糖時(shí)有乳糖時(shí)有葡萄糖cAMP濃度低RNA-polOOOOlac操縱子基因表達(dá)既需要乳糖又需缺乏葡萄糖2/6/202318Summary2/6/202319利用lacZ′基因的插入失活篩選重組子

—藍(lán)白篩選法

載體同時(shí)含氨芐青霉素抗性基因和lacZ′基因，外源基因插在lacZ′基因內(nèi)，受體細(xì)胞為lacZ′基因互補(bǔ)菌。在同時(shí)含氨芐青霉素和藍(lán)白篩選顯色劑（X-gal）的平板上篩選：未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng)；空載體轉(zhuǎn)化菌長(zhǎng)成藍(lán)色菌落；重組子長(zhǎng)成白色菌落。lacZ基因編碼β-半乳糖苷酶；lacZ′基因編碼β-半乳糖苷酶的N端序列α片段，互補(bǔ)菌染色體上攜帶的缺陷基因編碼C端片斷，兩者互補(bǔ)（α-互補(bǔ)）形成有功能的全酶。補(bǔ)充內(nèi)容2/6/202320X-gal