照明方式通常為落射式，即光源通過(guò)物鏡投射于樣品上；2.

光源為紫外光，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡；3.

有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見(jiàn)光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)人目。第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)暗視野顯微鏡

暗視野顯微鏡（darkfieldmicroscope）的聚光鏡中央有擋光片，使照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見(jiàn)到小至4-200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)倒置顯微鏡

組成和普通顯微鏡一樣，只不過(guò)物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，通常具有相差物鏡。

在裝配設(shè)計(jì)上趨于采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體，從而操作靈活，使用方便。第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)激光共聚焦掃描顯微鏡負(fù)責(zé)人羅禹電話：82655077

激光共聚焦掃描顯微鏡（laserconfocalscanningmicroscope）用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。由于激光束的波長(zhǎng)較短，光束很細(xì)，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)，調(diào)焦深度不一樣時(shí)，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過(guò)計(jì)算機(jī)重新組合，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)，給出細(xì)胞內(nèi)各部分之間的定量關(guān)系及各種結(jié)構(gòu)線度。第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)物鏡弧光燈熒光濾光鏡聚焦光圈目鏡濾光鏡激光器檢測(cè)針孔光源針孔光電倍增管熒光顯微鏡的工作原理激光掃描共聚焦顯微鏡的工作原理濾光鏡物鏡熒光濾光鏡第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的定量。第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)激光器的特點(diǎn):1)方向性好:激光基本沿直線傳播。2)單色性好:=10-8nm。3)高亮度:激光方向性好,其在空間上的能量分布是高度集中的。4)偏振性:激光為平面偏振光,光纖耦合。激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn)：1)點(diǎn)照明2)具有照明pinhole和探測(cè)pinhole3)照明pinhole和探測(cè)pinhole共軛(共焦),共焦點(diǎn)即被探測(cè)點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面為共焦平面4)具有掃描系統(tǒng)——逐點(diǎn)掃描成像5)具有多個(gè)（四個(gè)）熒光通道，可同時(shí)探測(cè)多個(gè)被標(biāo)記物第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用單、雙、三,四色標(biāo)記檢測(cè)。精確的一、二、三、四維觀察。高品質(zhì)的熒光成像、透射成像、物體表面反射成像。靜態(tài)和動(dòng)態(tài)觀察(CA2+,pH,膜電位,膜流動(dòng)性等)。定性以及定量分析。特殊的光反應(yīng)(FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED等)。第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)細(xì)胞內(nèi)自由基的變化第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)細(xì)胞內(nèi)NO的變化第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)細(xì)胞膜蛋白相互作用第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)原子力顯微鏡利用原子之間的范德華力（VanDerWaalsForce）作用來(lái)呈現(xiàn)樣品的表面特性。

第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

掃描電子隧道顯微鏡第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)二、顯微操作技術(shù)

顯微操作技術(shù)（micromanipulationtechnique）是指在高倍復(fù)式顯微鏡下，利用顯微操作器進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動(dòng)的機(jī)械裝置。

第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)三、圖像分析系統(tǒng)主要用于照片、實(shí)物、組織切片、細(xì)胞爬片等組織化學(xué)取圖和灰度分析。免疫組織化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源MAPKp42蛋白表達(dá)E

第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)三、激光顯微切割技術(shù)

第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)第四節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件無(wú)菌操作室、超凈工作臺(tái)（生物安全柜）、倒置顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、消毒設(shè)備、超聲清洗儀、烤箱、離心機(jī)、蒸餾水器（超純水）、液氮罐、冰箱、濾器以及天平等。相關(guān)設(shè)備：流式細(xì)胞儀、微板測(cè)試系統(tǒng)。二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識(shí)培養(yǎng)細(xì)胞的基本概念原代培養(yǎng)：直接從活體組織中分離出細(xì)胞，在培養(yǎng)條件下傳1至10代的培養(yǎng)方法。原代培養(yǎng)一般不能傳代太多，否則培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)走向衰老死亡。傳代培養(yǎng)：經(jīng)過(guò)一定處理，細(xì)胞適應(yīng)在體外條件下連續(xù)傳代的培養(yǎng)方法。第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

細(xì)胞株（cellline）：一般可傳40至50代的細(xì)胞。

細(xì)胞系（cellstrain

）：細(xì)胞株經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后可傳50代以上或無(wú)限傳代的細(xì)胞。第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿

原代培養(yǎng)期

傳代期

衰退期第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)2.培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式和類型生長(zhǎng)方式：貼附生長(zhǎng)型、懸浮生長(zhǎng)型。類型：上皮樣細(xì)胞、成纖維樣細(xì)胞。3.培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程存在三個(gè)過(guò)程：滯留期：細(xì)胞接種于新的培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞形態(tài)由圓形恢復(fù)原來(lái)形態(tài)的時(shí)期。此時(shí)，細(xì)胞尚未進(jìn)入增殖期。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞增殖旺盛，成倍增長(zhǎng)，活力最強(qiáng)的時(shí)期。適用于實(shí)驗(yàn)研究。平臺(tái)期：細(xì)胞生長(zhǎng)的底面積被生長(zhǎng)的細(xì)胞占滿，由于接觸抑制而細(xì)胞停止增殖的時(shí)期。4.細(xì)胞培養(yǎng)的注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞密度、培養(yǎng)基儲(chǔ)存時(shí)間、細(xì)胞培養(yǎng)傳代數(shù)（衰退期）。第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)三、細(xì)胞系建立的方法原代培養(yǎng)的方法（1）組織塊培養(yǎng)法（2）消化培養(yǎng)法細(xì)胞純化的方法（1）自然純化（2）人工純化酶消化法、差速貼壁法、機(jī)械鏟除法、克隆法、培養(yǎng)基限定法以及流式細(xì)胞儀分離法。第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)四、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要細(xì)胞的生存環(huán)境溫度:37℃

O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4

滲透壓無(wú)污染無(wú)毒第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)五、細(xì)胞檢測(cè)

計(jì)數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞Coulter計(jì)數(shù)儀：人工計(jì)數(shù)第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)

單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見(jiàn)的克隆。克隆形成卒用來(lái)表示細(xì)胞的增殖能力。

克隆形成率比＝克隆形成數(shù)／接種細(xì)胞數(shù)

缺點(diǎn)：操作繁瑣

優(yōu)點(diǎn)：精確、可靠

臺(tái)盼藍(lán)法

活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞恬力。

第五章

細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

四唑鹽（MTT）比色法

四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)。四吐鹽比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值

MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。第五章細(xì)胞研究的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)六、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇

凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水