ELISA知識簡介1.

ELISA的原理2.

ELISA的類型3.試劑準備：免疫吸附劑結合物酶底物的準備4.對照設定5.標本的采取和保存6.結果判斷

ELISA是一種免疫測定（immunoassay，IA）?；A:抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，由此進行定性或定量分析。1.

ELISA的原理1.1抗原抗體反應

1.1.1可逆性抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應式為：Ag+Ab→Ag·Ab

抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],Ag·Ab的解離程度與K值有關。高親和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空間構型上非常適合，兩者結合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結構和活性。1.1.2特異性

抗原抗體的結合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結合位點之間?；瘜W結構和空間構型互補關系，具有高度的特異性。

測定某一特定的物質，而不需先分離待檢物。

1.1.3最適比例

1.4免疫測定在臨床檢驗中的應用由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標本中相應的抗原，因此免疫測定的應用范圍極廣。2ELISA的類型ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結合物"（conjugate）；（3）酶反應的底物?？稍O計出各種不同類型的檢測方法。2.2.1雙抗體夾心法測抗原此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。2.2.3間接法測抗體

傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。2.2.4競爭法測抗體

當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。

2.2.5競爭法測抗原小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

2.2.7ABS-ELISA法

①：固相支持物；②：樣品；③：特異性IgG；④：生物素化抗小鼠IgG（Biotin）；⑤：辣根過氧化物酶HRP-酶標鏈親和素（Avidin）；⑥：DAB顯色液；⑦：顯色；3.ELISA的試劑(A、B、C三部分)ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標記的抗原或抗體（結合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對照品和陽性對照品，參考標準品；（5）結合物及標本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應終止液ELISA的試劑準備A

固相載體聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。不易吸附的非蛋白質抗原可用間接包被的抗原經固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。脂類物質無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質自然干固在固相表面。優(yōu)點：試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳?？乖昧可伲瑑H為直接包被的1/10乃至于/100。包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結合到固相載體表面。3.1.4包被用抗體IgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)結發(fā)生在Fc段上，抗體結合點暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液.須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。3.1.6封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉，可以高濃度使用（5%）。所有的ELISA固相均需封閉？3.4洗滌液在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。3.2.2酶純度高，催化反應的轉化率高，專一性強，性質穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標本中不存在相同的酶。酶結合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產物易于測定等。在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成，是一種卟啉蛋白質。3.2.3結合物的制備酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使酶與蛋白質的氨基通過它而聯(lián)結。有效（結合率達60%-70%）和重復性好。交聯(lián)反應是隨機的，結合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。（2）過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基形成chiff氏堿而結合。簡便有效.結合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測定。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，因此制備的酶結合物應予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。制得結合物，最適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。3.2.4結合物的保存酶和抗體均為生物活性物質，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉）。3.2.5結合物的稀釋液用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在反應中直接吸附在固相載體上：0.1%牛血清白蛋白，0.05%吐溫20。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達6個月。試劑準備C酶的底物3.3酶的底物3.3.1HRP的底物OPD氧化后的產物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物最常用的底物。DH2+H2O2

D+2H2O上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。DH2一般為無色化合物，經酶作用后成為有色的產物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS。ETMB經HRP作用后共產物顯藍色。TMB性質較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液。酶反應終止后，TMB產物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(ureaperoxide)。AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯作為底物。產物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。3.5酶反應終止液常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。4對照設定

陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結果的對照。 陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致，多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質。 加入的量應與試劑的敏感度相稱； 在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可以估計標本物質的量。參考標準品定量測定（如甲胎蛋白質，癌胚抗原測定等）應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中. 陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。5標本的采取和保存

體液、分泌物和排泄物等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。以血清標本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應用。血清標本應避免溶血：紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP為標記的ELISA測定中，可能會增加非特異性顯色。加樣:在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡?；静僮髯⒁馐马棻乜乖贵w完成反應的保溫過程稱為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育？溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。保溫方式：ELISA儀器附有特制的電熱塊，水浴。若用保溫箱：ELISA板放在濕盒內，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內，標準室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據說明書的要求控制溫育。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA洗滌：達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質，以及非特異性地吸附的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種：（1）流水沖洗式流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來水。洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。

（2）浸泡式微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，使蛋白質回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。顯色顯色是酶催化無色的底物生成有色產物的溫育反應。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當時間閱讀結果。TMB經HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。比色拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀中。以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。結果以光密度（oplicaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。酶標比色儀酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指測讀ELISA光度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數一般可精確到0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%。操作時室溫宜在15-30℃，使用前先預熱儀器15-30分鐘，測讀結果更穩(wěn)定。測讀A值時，要選用產物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀。各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書。6結果判斷

6.1定性測定定性測定的結果判斷作出“有”或“無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。根據滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性