固相萃取（SPE）技術2005年12月22日

固相萃取技術SPE一.概述二.SPE基本原理三.SPE法的優(yōu)點四.SPE裝置五.SPE的類型六.SPE方法的建立七.SPE的應用一.概述所謂萃取法,就是從樣品中提取組分,傳統(tǒng)的方法是液液萃取法(LLE),即用液體作為提取劑;我們這里探討的SPE,是用固體物質作為萃取劑,采用高效、高選擇性的固定相進行萃取的樣品預處理技術。SPE技術自上世紀70年代后期問世以來，發(fā)展迅速，廣泛應用于環(huán)境、制藥、臨床醫(yī)學、食品等領域。概述

樣品類型

SPE可以用于所有類型樣品的處理，但是液體樣品是最容易處理的。Surveyresponse%二.SPE基本原理SPE是一種吸附劑萃取，樣品通過填充吸附劑的一次性萃取柱，分析物和雜質被保留在柱上，然后分別用選擇性溶劑去除雜質，洗脫出分析物，從而達到分離的目的。SPE的分離模式主要取決于填充劑的類型和溶劑的性質。二.SPE基本原理SPE也是一個柱色譜分離過程，分離機理、固定相和溶劑的選擇等方面與高效液相色譜（HPLC）有許多相似之處。但是SPE柱的填料粒徑（>40μm）要比HPLC填料（3~10μm）大。由于短的柱床和大的粒徑，SPE柱效比HPLC色譜柱低得多。因此，用SPE只能分開保留性質有很大差別的化合物。與HPLC的另一個差別是SPE柱是一次性使用。四.SPE裝置CleanedpolyethylenefritsSorbentbedLuertip"Shrink-wrapped"polypropylene五.SPE的類型在SPE法中最常用的吸附劑是硅膠或鍵合相的硅膠即在硅膠表面的硅醇基團上鍵合不同的有機基團，如烷基鏈或其它官能團，如-OH、-C6H5、-NH2、-CN等。實際上吸附劑角色是由這些新接上的含官能基碳鏈來完成。

以硅膠為基質的吸附劑主要有以下優(yōu)點：粒徑（e.g.40μm)、孔徑（e.g.60A）、表面積（600m2/g)、鍵合量易控制；機械強度高；化學性質穩(wěn)定；適應性廣；可使用的溶劑種類多。五.SPE的類型依據柱中填料（吸附劑）來劃分，可將SPE法分為吸附型和鍵合相分配型（BPC）。吸附型SPE是采用極性較強的硅膠、硅藻土和氧化鋁等吸附劑，樣品進入柱中，分析物的極性官能團先迅速被吸附至極性吸附劑上，而后以低極性溶劑轉至中極性溶劑陸續(xù)洗去雜質及洗脫出分析物。五.SPE的類型

以硅膠為基質的固定相的分類NON-POLARPHASESC18OctadecylC2EthylCHCyclohexylPHPhenylPOLARPHASESCNCyanopropyl2OHDiolNH2AminopropylSISilicaION-EXCHANGEPHASESSCXStrongcationexchangerCBAWeakcationexchangerSAXStronganionexchangerNH2WeakanionexchangerSPECIALTYPHASESPBACERTIFYENVIRELUTACCUCATIncreasingpolarity五.SPE的類型

硅膠鍵合非極性固定相填充劑使用非極性烷烴類化學鍵合相（C18、C8、C6H5-C6H11等）的SPE分離方式稱為反相BPC。最適用于極性基質中萃取非極性化合物。當樣品溶液通過萃取柱時，雜質不被保留，直接通過柱子除去，只有分析物保留在柱上，只要選用一種合適的洗脫溶劑既可將其從柱上洗下。五.SPE的類型

分析物與非極性固定相的作用力NH2SO3-VanderWaalsforcesSilicabaseBondedfunctionalgroup(C8)五.SPE的類型

硅膠鍵合極性固定相

填充劑使用極性鍵合固定相（-NH2、-CN、-2OH等官能團）的SPE分離方式稱為正相BPC。其對極性分析物的吸附力不及分配型SPE大，故洗脫容易。在實際使用中，先以非極性溶劑清洗管柱，繼而加樣，分析物立刻會被吸附，然后以非極性溶劑洗去雜質，最后以極性溶劑洗脫分析物。五.SPE的類型

硅膠鍵合離子交換劑填充劑為硅膠基質的離子交換官能團有：季胺、氨基、二氨基、苯磺酸基、羧基等。此外常用的還有聚合物，如苯乙烯-而乙烯苯共聚物XAD-2及PRP-1等。相對于鍵合相填料，聚合物可適用于全部pH范圍，因而應用廣泛。對于酸性化合物，如有機酸、無機陰離子、酸性蛋白等，一般采用陰離子交換SPE柱；對于堿性化合物，如有機胺、金屬離子、兒茶酚胺和堿性蛋白等，采用陽離子交換SPE柱。SCXPRSCBASAXPSANH2StronganionStronganion,pKa<1Weakanion,pKa4.8StrongcationWeakcation,pKa10.9,10.1Weakcation,pKa9.8NHCH2CH2NH20.7meq/g0.3meq/gpH-sensitive0.8meq/gpH-sensitivepH-sensitiveSO3-SO3-NH2N+Me3CO2H硅膠鍵合離子交換劑

WeakorStrongAcids/Bases基體對選擇合適分離機制有著重要影響（e.g.)NH3+NH2NH2CompoundSuggestedmechanismNon-polarPolarIonexchangeMatrixtypeSalinesolutionOliveoilDrinkingwater五.SPE的類型

混合模式固定相SPE柱子類型的選擇1、Reversed-phasebondedsilicasorbentshavingalkylgroupssuchasoctadecyl(C18,C18),octyl(C8,C8),orethyl(C2,C2)covalentlybondedtothesilicagelbackboneorcyclohexyl(CH)orphenylgroupsandsorbentscomposedofpolymericresinssuchaspolystyrene–divinylbenzeneinteractprimarilywithanalytesviavanderWaalsforces.2、Nonionicwatersolublecompoundscanberetainedbyreversed-phasesorbentsbutmaynotbeaswellretainedasanalytesthataresolubleinmethanolormethanol–watermisciblemixtures.3、Normal-phasepolarsorbents,suchassilica,alumina,andFlorisil,andcyano(CN)bondedphasesinteractbypolar-dipole/dipoleforcesbetweenpolarfunctionalgroupsintheanalyteandthepolarsurfaceofthesorbent.4、Amino(NH2)anddiolsorbentsinteractwithanalytesbyhydrogenbonding.5、Hexane-solubleanalytesarebestretainedbynormalphasesorbentssuchassilicaorFlorisilorpolarfunctionallysubstitutedbondedphasessuchasaminoordiol.6、Strongcation-exchange(SCX)andstronganion-exchange(SAX)sorbentsinteractprimarilythroughelectrostaticattractionsbetweenthesorbentandtheanalyte.7、GraphitizedcarbonsorbentsexhibitbothnonspecificvanderWaalsinteractionsandanionexchange,orelectrostatic,attractionforanalytes.1、DependenceofSorptiononSamplepH

Ifacompoundisionizable,theextractionwillbepHdependent.Monomethyl(MMP),Monoethyl(MEP),Mono-n-propyl(MPRP),Mono-n-butyl(MBP),Mono-n-pentyl(MPEP),Mono-n-octyl(MOP)Phthalates（鄰苯二甲酸鹽酯）2、DependenceofSorptiononSampleVolume

Breakthroughvolumeasthepointatwhich1%ofthesampleconcentrationattheentranceofthesorbentbedisdetectedattheoutletofthesorbentbed.Thetypeandquantityofsorbent,hydrophobicityandionizabilityoftheanalytes,andsamplevolumeandpHinteractivelydeterminethebreakthroughvolume.Thebreakthroughvolumeforaspecificmassofsorbentcanbeestablishedbyeitherloadingvariable-volumesamplesofconstantconcentrationorvariable-volumesamplesofvariableconcentration,inwhichcasethelattercomprisesaconstantmolaramountloaded。Alternatively,methodsexistforpredictingthebreakthroughvolume.六.SPE方法的建立

柱預處理-Condition柱預處理有兩個目的:一個目的是除去填料中可能存在的雜質；另一個目的是使填料溶劑化，提高固相萃取的重現(xiàn)性。填料未經預處理或者未被溶劑濕潤，能引起溶質過早穿透，影響回收率。

對于非極性相和離子交換SPE柱使用的柱預處理溶劑為易溶于水的甲醇、乙腈、四氫呋喃和丙酮。通常還要用水或緩沖液洗去殘留在柱上的有機溶劑。六.SPE方法的建立

柱預處理-Condition

對于極性的SPE柱，非極性溶劑適合用于預處理過程。通常很少有人用極性溶劑去處理極性的SPE柱，

因為極性溶劑會與鍵合相發(fā)生作用，減少吸附劑的與樣品作用的表面積。六.SPE方法的建立

柱預處理–WhyCondition？ConditionedsorbentUnconditionedsorbentGoodtransportbetweensampleandsorbent六.SPE方法的建立

加樣-LoadSample預處理后，試樣溶液被加至并通過SPE柱。在該步驟，分析物及雜質被保留在吸附劑上。為了防止分析物的流失，試樣溶劑強度不宜過高。當以反相機理萃取時，以水或緩沖劑作為溶劑，其中有機溶劑量不超過10%（V/V）。為克服加樣過程中分析物流失，可采用弱溶劑稀釋試樣、減少試樣體積、增加SPE柱中的填料量和選擇對分析物有較強保留的吸附劑等手段。六.SPE方法的建立

除去干擾雜質-Wash用中等強度的溶劑，將干擾組分洗脫下來，同時保持分析物仍留在柱上。對反相萃取柱，清洗溶劑是含適當濃度有機溶劑的水或緩沖溶液。通過調節(jié)清洗溶劑的強度和體積，盡可能多地除去能被洗脫的雜質。為了決定最佳清洗溶劑的濃度和體積，加試樣于SPE柱上，用5~10倍柱床體積的溶劑清洗，依次收集和分析流出液，得到清洗溶劑對分析物洗脫廓形。增加清洗溶劑強度，根據不同強度下分析物的洗脫廓形，決定清洗溶劑合適的強度和體積。六.SPE方法的建立

分析物的洗脫和收集-Elution這一步驟的目的是將分析物完全洗脫并收集在最小體積的組分中，同時使比分析物更強保留的雜質盡可能多地仍留在SPE柱上。洗脫溶劑的強度是至關重要的。較強的溶劑能夠使分析物洗脫并收集在一個小體積的級分中，但有較多的強保留雜質同時被洗脫下來。當用較弱的溶劑洗脫，分析物級分的體積較大，但含較少的雜質。為了提高分析物的濃度或要進行溶劑轉換，可以把收集到的分析物級分用氮氣吹干，再溶于小體積適當?shù)娜軇┲?。?SPE方法的建立RetentionRinsingElutionSamplematrixWashsolventElutionsolvent六.SPE方法的建立從SPE的操作步驟可以看出，SPE的重現(xiàn)性受多個因素的影響，實驗條件是影響重現(xiàn)性的主要原因。提高重現(xiàn)性的方法有（1）使用替代物，加入適當?shù)奶娲镒鰠⒈龋唬?）加入樣品量適當，不超出穿透量和穿透體積；（3）選擇合適的洗滌液和洗脫液，確保分析物在操作中不流失。七.SPE的應用

非極性SPE柱VitaminK1fromSerumusingC83OOSurrogate,vitaminK1(25),containsadditional1-methylbutylgroup七.SPE的應用

非極性SPE柱Condition:2.0mLMeOH,1.0mLH2OLoadSample:50mLserum,30mLI.S.,1mLH20Wash:2×1.0mLH20,dryundervacuumfor1minuteElute:HPLCmobilephase-AcCN/IPA/DCM(7:1:2v/v)2×150mLSPE柱:C8柱選擇C8是因為維生素K1是親脂性的，并且比C18柱更易于洗脫下來，洗脫之前一定要除去柱上的水分。分析儀器：HPLC-DAD檢測器七.SPE的應用

極性SPE柱HO

Cholesterol膽固醇cholesterylester膽甾醇酯Triglyceride甘油三酸酯Diglyceride甘油二酯Monoglyceride甘油一酸酯freefattyacid脂肪酸Phospholipid磷脂ClassFractionationofaLipidMixtureonNH2Sorbent七.SPE的應用

極性SPE柱Samplepre-treatment:Plasmalipidswereextractedanddried,thenreconstitutedinCHCl3.Methoddevelopmentstartedfromconsiderationoflipidstructure(possibleanionexchange,H-bonding,dipolarandnon-polarinteractions.TLCdataprovidedindicationonsuitablesorbenttypesforscreening.Solubilitydatawasalsousedtodevisesuitablewash/elutionsolventtrials.七.SPE的應用

極性SPE柱

Solventtype

P

LipidclasselutedA2:1CHCl3/IPA

4.07

AllneutrallipidsB2%AcOHinEtOEt2.86

FattyacidsCMeOH

5.10

AllphospholipidsDHexane

0.01

CholesterylestersE1%EtOEt/10%0.44

TriglyceridesDCMinhexaneF5%EtOAcinhexane0.32

CholesterolG15%EtOAcinhexane0.62

DiglyceridesH1:1CHCl3/MeOH

4.43Monoglycerides七.SPE的應用

極性SPE柱C,CETG,DG,MGCEPLACDPLFABC,TGDGMGCEDFAPLC,TGDGMGAthreecartridgesequencethatpermitsbestseparation七.SPE的應用

極性SPE柱CCFFMGHCTGEDGMGCDGMG