檸檬酸發(fā)酵工藝第一頁，共八十六頁，2022年，8月28日

幾乎所有含淀粉和可發(fā)酵性糖類的農(nóng)副產(chǎn)品，都可作為檸檬酸發(fā)酵原料。由于各種原料中非糖類雜質(zhì)的組分和量的不同，因此需要采用不同的理化方法進行預處理，以適應檸檬酸生產(chǎn)菌的發(fā)酵條件。第一節(jié)發(fā)酵原料的預處理第二頁，共八十六頁，2022年，8月28日所謂預處理，主要是指除雜、粉碎、液化、過濾等處理程序。至于采用何種程序和方法則取決于選用的原料品種及其內(nèi)在質(zhì)量。例如:薯類和谷類原料的除雜是利用機械或人工除去混入其中的固體雜質(zhì)，如金屬物、土、石、皮、芯、粒、霉變塊等雜物。而糖蜜的除雜則是利用化學方法除去溶解于糖蜜中的雜質(zhì)。又如，粉碎和過濾是根據(jù)原料的特性來選擇適用的機械設(shè)備即可解決。淀粉的液化和糖蜜的除雜則是討論的重點。第三頁，共八十六頁，2022年，8月28日一、淀粉質(zhì)原料的液化（一）液化的基本概念（二）酶法液化淀粉的方法（三）檸檬酸工業(yè)用的噴射液化工藝（四）液化方法比較第四頁，共八十六頁，2022年，8月28日（一）液化的基本概念

利用化學催化劑或生物催化劑，在具有一定量的水和一定的溫度條件下，使淀粉分子斷裂而變成較小分子，使淀粉糊的黏度顯著下降而成為流動性較好的流體，工業(yè)上稱為“淀粉液化”。第五頁，共八十六頁，2022年，8月28日淀粉液化的方法1、酸法：以強酸為催化劑，高溫、高壓條件下進行，液化程度較難掌握2、酶法：采用α-淀粉酶，在中性溶液中，常溫、常壓條件下進行，液化程度容易掌握。此法適應于檸檬酸工業(yè)。3、機械液化：不使用催化劑，使淀粉漿噴射入一個旋轉(zhuǎn)的蒸汽加熱器中，受熱淀粉立即糊化，在強烈的機械剪力的作用下，使淀粉分散。不破壞淀粉顆粒表面和結(jié)晶結(jié)構(gòu)。第六頁，共八十六頁，2022年，8月28日

淀粉的液化實質(zhì)上是在淀粉顆粒因受熱吸水膨脹、糊化破壞了其結(jié)晶結(jié)構(gòu)之后進行的，這是因為淀粉顆粒對于酶作用的抵抗力較強，很難直接液化。例如：細菌α-淀粉酶水解淀粉和水解糊化淀粉速度比為1：20000，因此淀粉乳糊化是酶法液化的第一個重要的步驟。第七頁，共八十六頁，2022年，8月28日淀粉在常溫下不溶于水，但當水溫至53℃以上，淀粉的物理性能發(fā)生明顯變化。淀粉在高溫下溶脹、分裂形成均勻糊狀溶液的特性，稱為淀粉的糊化。

生淀粉在水中加熱至膠束結(jié)構(gòu)全部崩潰，淀粉分子形成單分子，并為水所包圍而成為溶液狀態(tài)。淀粉糊化溫度必須達到一定程度，不同淀粉的糊化溫度不一樣，同一種淀粉，顆粒大小不一樣，糊化溫度也不一樣，顆粒大的先糊化，顆粒小的后糊化。第八頁，共八十六頁，2022年，8月28日淀粉被糊化后，體積膨脹很多，粘度增強、流動性很差、攪拌困難、影響傳熱，難以糊化均勻。因此淀粉質(zhì)的檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基在滅菌前必須先進行液化，使料液的流動性好，有利于料液的輸送、滅菌完全、發(fā)酵初期的生長、易于糖化、提高產(chǎn)酸率和淀粉的利用率。發(fā)酵成熟醪過濾性好、也有利于發(fā)酵罐攪拌功率的下降。第九頁，共八十六頁，2022年，8月28日α-淀粉酶是一種金屬酶，Ca2+使α-淀粉酶保持適當?shù)臉?gòu)象，從而維持其最大的活性和穩(wěn)定性．除Ca2+外，其它二價堿金屬離子Ba2+、Mg2+等也有維持α-淀粉酶活性的作用．但耐高溫α-淀粉酶在Ca2+濃度很低時，穩(wěn)定性就很好。在實際使用時，不需添加Ca2+等穩(wěn)定劑。第十頁，共八十六頁，2022年，8月28日（二）酶法液化淀粉的方法按工藝條件分類：間歇液化法、半連續(xù)液化法、連續(xù)液化法；按設(shè)備條件分：罐式、管式、噴射式；按加酶方式分：一次、二次、三次加酶多段液化工藝。第十一頁，共八十六頁，2022年，8月28日間歇液化法又稱為直接升溫液化法。此法最為簡單，但是液化效果最差。具體操作如下：在淀粉漿罐中將物料調(diào)成漿乳，調(diào)節(jié)pH和加鈣離子，攪拌升溫到50℃左右，加入需要量的α-淀粉酶，繼續(xù)升溫到80-85℃，恒溫保持30-60min，至碘不顯藍色為止，然后升溫至沸騰。使蛋白質(zhì)凝固，酶完全失活，移后續(xù)工段處理。第十二頁，共八十六頁，2022年，8月28日此法與檸檬酸行業(yè)常用的罐內(nèi)液化、滅菌合一的工藝相類似。由于檸檬酸生產(chǎn)沒有深入研究液化對糖酸轉(zhuǎn)化率的影響，因而操作更加粗放，但此法對淀粉的液化不均勻完全。第十三頁，共八十六頁，2022年，8月28日半連續(xù)液化又稱高溫液化法，是針對間歇液化法存在的缺陷而進行改進的工藝。操作是在一只裝有中間套筒的錐底液化罐中進行，其目的是控制液化料液先進先出，力求淀粉受熱和酶作用時間一致。實踐證明，雖然液化效果明顯優(yōu)于直接升溫法，但仍有液化不均現(xiàn)象。第十四頁，共八十六頁，2022年，8月28日連續(xù)液化法又稱噴射液化法。此法被認為是最好的淀粉液化工藝。噴射液化法可以一次加酶一次噴射，也可以二次加酶二次噴射，主要取決于所用原料性質(zhì)和要求液化程度。檸檬酸工業(yè)用于玉米粉的液化是采用二次加酶二次噴射工藝。第十五頁，共八十六頁，2022年，8月28日噴射液化是在噴射器中進行瞬間液化，噴射液化器有高壓蒸汽噴射器，其結(jié)構(gòu)是根據(jù)文丘里管的原理設(shè)計的。文丘里管，是新一代差壓式流量測量儀表，其截面起初逐漸縮小而后逐漸擴大到原來尺寸的縮放管。以能量守恒定律——伯努力方程和流動連續(xù)性方程為基礎(chǔ)的流量測量方法。第十六頁，共八十六頁，2022年，8月28日噴射液化的過程當高壓蒸汽通過噴嘴，使噴射器的內(nèi)腔形成真空，混有α-淀粉酶的淀粉乳，在此力的引吸和泵的推動力作用下，呈薄膜狀進入噴射器內(nèi)腔，隨即與蒸汽混合形成湍流，料溫驟升至100-120℃，瞬間完成了糊化、液化，淀粉糊粘度迅速下降，形成流體從噴射器下部出料口排至保溫系統(tǒng)，恒溫90℃維持30-60分鐘，達到需要的液化程度。第十七頁，共八十六頁，2022年，8月28日噴射液化設(shè)備流程圖第十八頁，共八十六頁，2022年，8月28日噴射液化的優(yōu)點：液化均勻完全、已切斷的淀粉連不易重新聚合、蛋白質(zhì)類雜質(zhì)凝固好，過濾性能佳、設(shè)備體積小、可連續(xù)化操作。噴射液化最適合用耐高溫α-淀粉酶。但這類噴射器，要求在穩(wěn)定的0.4—0.6MPa的飽和蒸汽條件下操作。第十九頁，共八十六頁，2022年，8月28日HYW型低壓蒸汽噴射液化器，其特點是提高料液的輸送壓力作為推動力，替代了蒸汽壓力。因此，可以在較低的蒸汽壓力下液化，也可用過熱蒸汽液化，因而減少了噴射器的振動和噪聲。第一次噴射溫度為105℃，但若用二次噴射液化工藝，則第二次噴射的溫度要求達到120-145℃，因此供氣壓力不能低于0.5MPa(表壓）。第二十頁，共八十六頁，2022年，8月28日（三）檸檬酸工業(yè)用的噴射液化工藝

玉米→浸泡→粉碎脫胚→原漿→調(diào)漿PH值6.4～7.0→一次噴射液化溫度為95℃～97℃→層流罐→二次噴射液化溫度為140℃～145℃→閃冷→中溫液化溫度在90℃左右→調(diào)節(jié)PH4.8～5.2→過濾去渣稀石灰水稀HCl或稀H2SO4用玉米發(fā)酵檸檬酸，采用HYW噴射液化器，二次加酶液化工藝：第二十一頁，共八十六頁，2022年，8月28日具體操作：用溫水將玉米粉調(diào)成漿乳，加稀石灰水調(diào)整pH至，加需要酶量的2/3，備用；通蒸汽進噴射器、保溫系統(tǒng)，待出口溫度達90℃以上時，打開漿料回流閥，開始將漿料泵入噴射器進行液化，出料口溫度達到95-97℃時，關(guān)小回流閥，料液進入層流罐，在90-95℃條件下，維持30-60分鐘；然后進行二次噴射，料溫達到140-145℃，進入維持罐維持3-5分鐘后，經(jīng)閃冷器迅速降溫后落入二次液化罐中，加余下的1/3淀粉酶，在90℃左右維持30分鐘，碘檢查無藍色反應，然后用稀酸調(diào)pH至，趁熱過濾去渣。調(diào)整好氮源之后，經(jīng)連消或?qū)嵪蟀l(fā)酵。第二十二頁，共八十六頁，2022年，8月28日玉米粉發(fā)酵檸檬酸二次噴射液化工藝流程圖第二十三頁，共八十六頁，2022年，8月28日

二次加酶二次高溫噴射工藝有利于蛋白質(zhì)類雜質(zhì)進一步凝固，并可使玉米皮松軟，附著其中的淀粉大部分可在二次液化時被利用。噴射液化料液中不溶性淀粉顆粒和過濾性能優(yōu)于升溫法。噴射和升溫液化法過濾性質(zhì)比較項目噴射液化升溫液化濾液葡萄糖值/%97.196.9濾液比旋光度[α]D2056.757.2濾餅不容物含量/%0.72.67過濾速度/[/(m2?h)]630183第二十四頁，共八十六頁，2022年，8月28日（四）各種液化方法比較液化方法基本條件優(yōu)點缺點酸法液化淀粉乳濃度30%，pH1.8~2.0，液化溫度135℃。10min液化DE值15~18%適合任何精制淀粉，所得的糖化液過濾性能好有副反應生成有色物及復合糖類，淀粉轉(zhuǎn)化率低，糖液質(zhì)量差，糖化液中含有微量醇和不溶性糊精酶法液化1、間歇液化法（直接升溫液化法）淀粉乳濃度30%，pH6.5，Ca2+0.01mol/L,液化溫度85~90℃，30~60min液化DE值15~18%設(shè)備要求低，操作容易液化效果一般，經(jīng)糖化后的糖化液過濾性差，糖濃度低2、半連續(xù)液化法（高溫液化法）3、連續(xù)液化法（噴射液化法）淀粉乳濃度30%，pH1.8~2.0，液化溫度90℃。30~60min液化DE值15~18%淀粉乳濃度30%，pH6.5，液化溫度95~140℃，10~120min液化DE值15~17%設(shè)備要求低，操作容易，效果比直接升溫好液化效果好，液化液清亮、透明，質(zhì)量好，葡萄糖的收率高料液容易濺出，操作安全性差，蒸汽用量大，液化溫度未達到高溫酶的最適溫度，液化效果一般，糖化液過濾性能差機械法旋轉(zhuǎn)蒸汽加熱器，噴射溫度大于160℃，糊精的聚合度200~300液化液較有利于糖化酶結(jié)合，糖化后的糖化液DE值可達99%，適合于各類淀粉工藝過程有待于進一步完善第二十五頁，共八十六頁，2022年，8月28日二、糖蜜原料的預處理1·黃血鹽法

2·離子交換法

3·其他處理方法第二十六頁，共八十六頁，2022年，8月28日（一）黃血鹽法黃血鹽性質(zhì)黃血鹽化學名稱為亞鐵氰化鉀K4Fe(CN)6，淺黃色，片狀八面晶體。黃血鹽作用（1）與Fe3+反應形成普魯士藍沉淀，可除去糖蜜中的Fe3+等離子。

黃血鹽還可與其他金屬離子如Cu2+、Zn2+、Mn2+等形成沉淀而除去之。故用黃血鹽處理過的糖蜜中的灰分及磷的含量均有明顯的降低。這是黃血鹽處理糖蜜所起的主要作用。第二十七頁，共八十六頁，2022年，8月28日（2）黃血鹽在弱酸性培養(yǎng)基中能與蛋白質(zhì)形成不容性化合物。

故黃血鹽也能除去少量蛋白質(zhì)，但此反應是在弱酸性條件下進行的，如果酸性太強，特別是受熱后黃血鹽會分解。（3）黃血鹽在水中可能發(fā)生部分水解，使溶液呈堿性。（4）在中性和堿性條件下，有氧存在時，黃血鹽的水解產(chǎn)物〔Fe(CN)6〕4-會形成Fe(OH)3沉淀。因此，用黃血鹽處理糖蜜時，必須注意控制pH，一般認為在微酸性條件下，更有利于除去糖蜜中對檸檬酸發(fā)酵有害成分。第二十八頁，共八十六頁，2022年，8月28日關(guān)于黃血鹽處理糖蜜后能促進檸檬酸的產(chǎn)酸問題，過去認為Fe2+是黑曲霉三羧酸循環(huán)中烏頭酸酶的激活劑，烏頭酸酶活力高不利于檸檬酸積累，因此要除去Fe2+，故黃血鹽能促進產(chǎn)酸?，F(xiàn)在看來其作用機理并非如此簡單，在有些不受Fe2+影響的菌株，黃血鹽也同樣有利于檸檬酸積累，所以在檸檬酸發(fā)酵過程中，黃血鹽對糖蜜所起的作用可能是多方面的。第二十九頁，共八十六頁，2022年，8月28日（二）離子交換法離子交換樹脂可以除去糖蜜中對檸檬酸發(fā)酵有害的金屬離子。稀釋后的糖蜜可通過強酸性陽離子交換樹脂處理，使糖蜜中含鐵量下降。其他金屬離子也會被除去。必要時也可再經(jīng)過一次陰離子交換樹脂處理。離子交換法處理過的糖蜜，在配制發(fā)酵培養(yǎng)基時應添加黑曲霉生長所必需的無機鹽類。通過陽離子交換樹脂處理的糖蜜PH偏酸性，需加堿調(diào)整。第三十頁，共八十六頁，2022年，8月28日（三）其他處理法先用含鹽酸的磷酸三鈣處理，再用葡聚糖處理甘蔗糖蜜，能獲得很好的效果。用酸（硫酸或磷酸）和堿（石灰乳）交替處理，可以除去糖蜜中可沉淀物質(zhì)。

這些方法都有利于提高檸檬酸的產(chǎn)酸水平。第三十一頁，共八十六頁，2022年，8月28日

第二節(jié)檸檬酸深層發(fā)酵工藝

一、黑曲霉檸檬酸發(fā)酵條件控制1·營養(yǎng)要求2·溫度控制3·PH控制4·接種量和方式5·溶氧量的控制第三十二頁，共八十六頁，2022年，8月28日(一)營養(yǎng)要求

黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌是化能異養(yǎng)微生物，只能利用有機碳源；要使黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌大量生成和積累檸檬酸，必須控制營養(yǎng)物質(zhì)的供給，使菌體生長受限制，處于半“饑餓”和代謝失調(diào)狀態(tài)。

依據(jù)檸檬酸發(fā)酵機制，黑曲霉大量生成和積累檸檬酸的基本條件，是提供高濃度的葡萄糖和充足的氧。

第三十三頁，共八十六頁，2022年，8月28日碳源

碳源除了合成細胞物質(zhì)和提供維持生命活動的能量外，主要用于合成代謝產(chǎn)物。

從檸檬酸生產(chǎn)角度看，葡萄糖、蔗糖、糊精是良好的碳源，高糖濃度是檸檬酸發(fā)酵的一大特征。工業(yè)上為降低生產(chǎn)成本，多采用廉價的甘薯、玉米、小麥及其淀粉、糖蜜等。第三十四頁，共八十六頁，2022年，8月28日氮源

氮源的作用是合成細胞物質(zhì)和代謝調(diào)節(jié)，這是因為細胞中銨離子濃度的升高，能解除ATP和檸檬酸對關(guān)鍵酶磷酸果糖激酶的反饋抑制，使EMP代謝流增強，有利于檸檬酸生成與積累。

一般檸檬酸發(fā)酵采用的氮源有：（1）生理酸性氮：（NH4)2SO4、（NH4)3PO4、NH4Cl、（NH4)2CO3等；（2）生理堿性氮：Ca（NO3）2、Mg（NO3）2、NaNO3、KNO3等；（3）兩性氮：NH4NO3;(4)有機氮：麩皮、米糠、蛋白胨、氨基酸、尿素等。第三十五頁，共八十六頁，2022年，8月28日當有機氮和無機氮同時存在時，黑曲霉首先利用無機氮；在無機氮中，黑曲霉偏好生理酸性無機氮，這是因為生理酸性氮中的銨離子被利用后，使培養(yǎng)基變酸，可以使發(fā)酵中的黑曲霉生長階段結(jié)束，進入產(chǎn)酸階段，PH下降到較低水平有利于檸檬酸的積累；所以銨鹽既可以調(diào)節(jié)代謝，也可以控制pH。如果原料中有機氮含量過分豐富，菌生長代謝加快，對縮短發(fā)酵周期有利。但是不利于檸檬酸積累、產(chǎn)酸率不高。這就是不能利用含蛋白質(zhì)豐富的粗玉米粉直接發(fā)酵的原因。第三十六頁，共八十六頁，2022年，8月28日無機鹽

無機鹽是構(gòu)成微生物生命活動不可缺少的物質(zhì)。在檸檬酸發(fā)酵中，有的構(gòu)成菌體，有的促進代謝，有的促進產(chǎn)酸等，因此對黑曲霉的生長和檸檬酸發(fā)酵具有重要的作用。

無機鹽對檸檬酸發(fā)酵影響是十分復雜的，它因菌種、原料、生產(chǎn)方式不同而不同。第三十七頁，共八十六頁，2022年，8月28日(二)溫度控制

黑曲霉屬嗜熱微生物，最適生長溫度為33～37℃。

一般認為，深層液體發(fā)酵中，溫度低于28℃，導致長菌和產(chǎn)酸緩慢；高于37℃，導致菌體和雜酸形成過量，呼吸作用加強，影響糖酸轉(zhuǎn)化率。第三十八頁，共八十六頁，2022年，8月28日(三)PH控制

黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌生長發(fā)育適宜pH3~7。

一般認為，菌種生長期pH維持在4.5；產(chǎn)酸期的最適pH為2.0~3.0。pH3.0以上容易產(chǎn)生草酸，5.0容易生成葡萄糖酸，3.0以下是檸檬酸積累的條件。第三十九頁，共八十六頁，2022年，8月28日(四)接種量和接種方式接種量：接種量大小直接決定于進入培養(yǎng)系統(tǒng)的孢子數(shù)量。在一定范圍內(nèi)，孢子接種量與產(chǎn)酸數(shù)量成正比，隨著孢子接種量的增加，檸檬酸產(chǎn)率也提高。接種方式：孢子直接接種和菌絲體（種子罐）接種。

第四十頁，共八十六頁，2022年，8月28日

發(fā)酵罐試驗中用同樣數(shù)量的孢子進行孢子接種和二級培養(yǎng)后的菌絲接種，所得結(jié)果證明：孢子接種雖然初期產(chǎn)酸緩慢，但發(fā)酵24h后，生酸速率明顯提高，而且有后勁，最終產(chǎn)酸率高于菌絲種子。菌絲種子接種時，在同樣接種量的條件下，產(chǎn)酸水平隨著營養(yǎng)成分加高而提高。

另外，菌絲接種時，如果接入發(fā)酵罐的種子內(nèi)存在雜菌，這些雜菌從受到低pH抑制的種子培養(yǎng)基環(huán)境，恢復到自然pH環(huán)境的發(fā)酵液中，正好適宜多數(shù)雜菌繁殖。若生產(chǎn)菌株不能迅速產(chǎn)酸以降低pH，染菌幾率則增大。事實證明采用孢子接種能收到良好的效果。第四十一頁，共八十六頁，2022年，8月28日(五)溶解氧的控制黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌是嚴格的好氧微生物，不管生長、繁殖、還是產(chǎn)酸均需要氧。黑曲霉生長、繁殖所需的能量是通過呼吸作用獲得的，即葡萄糖徹底氧化為二氧碳和，產(chǎn)生大量的ATP(約38個），此過程需要大量的氧；乙酰CoA和草酰乙酸縮合生成檸檬酸過程中要引入一個氧原子，顯然氧也是檸檬酸合成所必需的底物之一。第四十二頁，共八十六頁，2022年，8月28日

黑曲霉的產(chǎn)酸速率幾乎與溶氧分壓成正比。低溶氧下產(chǎn)酸能力會降低甚至喪失，而且很少能重新恢復。因此檸檬酸發(fā)酵中，必須供給充足的氧。黑曲霉生長期溶氧分壓不得低于1.8KPa，產(chǎn)酸期溶氧分壓不得低于3.2KPa。第四十三頁，共八十六頁，2022年，8月28日

0204060800.40.81.21.6氧氣消耗速率發(fā)酵時間由圖所知，菌體生長過程呼吸作用消耗大量氧氣，當菌體生長接近對數(shù)生長期時（20~24h），需要氧達到最高峰，隨后菌體生長緩慢，進入產(chǎn)酸期（24~30h），氧的消耗率降低，并持續(xù)到發(fā)酵終了。第四十四頁，共八十六頁，2022年，8月28日根據(jù)這個原理，目前國內(nèi)采用的二級通風量有不足之處，一是菌體生長后期風量不足，影響菌體充分生長；二是產(chǎn)酸后期通風往往超過需要，造成動力浪費。同時過量的通風還可能降低發(fā)酵液中的二氧化碳的濃度，影響二氧化碳固定化反應，造成碳源的損失，從而降低糖-酸的轉(zhuǎn)化率。第四十五頁，共八十六頁，2022年，8月28日二、檸檬酸深層發(fā)酵工藝流程原料粉碎培養(yǎng)基配制實罐液化原始菌種環(huán)境空氣預處理連消實罐滅菌試管斜面過濾麩曲菌種空壓機種子罐空氣凈化系統(tǒng)發(fā)酵無菌空氣成熟發(fā)酵醪去檸檬酸提取工段第四十六頁，共八十六頁，2022年，8月28日三、薯干原料發(fā)酵工藝（一）生產(chǎn)菌種

當前生產(chǎn)上使用的具有代表性菌種是：Co827、γ-130、γ-144-130等。第四十七頁，共八十六頁，2022年，8月28日（二）生產(chǎn)工藝條件1、碳氮比

薯類原料由于產(chǎn)地等客觀條件不同，其組織中各種物質(zhì)含量各異，尤其蛋白質(zhì)含量差異較大。一般甘薯干蛋白質(zhì)含量在6%~7%，用于現(xiàn)有生產(chǎn)菌種，不需要調(diào)節(jié)含氮量。

木薯干含蛋白質(zhì)僅1.7%~2.6%，則需要用玉米粉、米糠、麩皮等有機氮源和適量的無機氮源來補充。第四十八頁，共八十六頁，2022年，8月28日2、溫度

黑曲霉發(fā)酵檸檬酸溫度控制在28~30℃時，檸檬酸產(chǎn)率最高，發(fā)酵速率也最快。

為了節(jié)約降溫能耗，我國在選育薯干發(fā)酵菌種時，有意地提高馴育溫度，故可在37℃條件下發(fā)酵。

在正常情況下發(fā)酵過程中的檸檬酸、糖、pH、草酸的消長如下圖所示：第四十九頁，共八十六頁，2022年，8月28日薯干原料正常發(fā)酵過程中各參數(shù)變化情況第五十頁，共八十六頁，2022年，8月28日3、pH

發(fā)酵的最適pH，分為起始和過程中的pH，實驗證明：薯干發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌前將pH降到4.0，滅菌后pH為5.0時，發(fā)酵效果最好。4、控制生物量

正常發(fā)酵液中生物量應控制在12~20g/L，過多的生物量會影響氧的溶解，增加發(fā)酵罐攪拌功率，且消耗了大量的葡萄糖。第五十一頁，共八十六頁，2022年，8月28日5、嚴防缺氧

檸檬酸發(fā)酵是典型的好氧發(fā)酵，對氧十分敏感。當發(fā)酵進入產(chǎn)酸期時只要有幾分鐘的缺氧時間，就會對發(fā)酵造成嚴重影響。

缺氧、供氧不足、溶氧不良都會使菌體發(fā)生異狀變化，產(chǎn)酸大幅度下降，有時發(fā)酵液會產(chǎn)生黃色熒光色素，非正常與正常發(fā)酵過程的情況對比，如下圖所示：第五十二頁，共八十六頁，2022年，8月28日第五十三頁，共八十六頁，2022年，8月28日6、孢子接種數(shù)與菌球體的特征

檸檬酸發(fā)酵液中的菌球體，是由一個或數(shù)個孢子在生長過程中物理作用而形成的。

一般來說，菌球體越小、越多，產(chǎn)酸就越高，發(fā)酵周期也短。接種孢子數(shù)與菌球體量（個/mL)成正比，與菌球體直徑成反比。孢子數(shù)不足，菌球體大或大小不勻。

薯干原料深層發(fā)酵大罐菌球體直徑<0.1mm，菌球體濃度>1000個/mL，而且表面毛糙的菌球體為佳。第五十四頁，共八十六頁，2022年，8月28日7、通風量檸檬酸發(fā)酵通風量相對來說并不大。通風量不是一個固定值，應根據(jù)培養(yǎng)基的質(zhì)量、菌種生長需要、發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)及其攪拌漿葉的型式和周線速度以及罐壓而定。

一般規(guī)律是發(fā)酵罐容積越大、培養(yǎng)液層越厚、攪拌轉(zhuǎn)速越快則通風量越小。通風量過大菌體過早進入衰老期，也不利于CO2固定，且動力浪費過多。氧的溶解與攪拌轉(zhuǎn)速、罐壓成正比關(guān)系；與溫度和培養(yǎng)基粘度成反比關(guān)系。

在同等條件下，一般通風量：機械攪拌式發(fā)酵罐<噴環(huán)式攪拌發(fā)酵罐<內(nèi)循環(huán)無攪拌發(fā)酵罐。第五十五頁，共八十六頁，2022年，8月28日8、接種方式（a）孢子直接接種

孢子直接接種即所謂的一級接種工藝，將孢子直接接種到發(fā)酵罐中。目前大多是作為當種子罐（二級種子）出現(xiàn)質(zhì)量問題或因生產(chǎn)中的突發(fā)事件而二級種子不能及時供應時的一個補救措施。

實際上孢子直接接種完全可以作為正常生產(chǎn)工藝使用。第五十六頁，共八十六頁，2022年，8月28日孢子直接接種的優(yōu)點直接接入發(fā)酵罐培養(yǎng)液中孢子數(shù)與接進種子罐的孢子相同，則與二級接種所產(chǎn)生的生物量基本相當，因為在種子罐內(nèi)不會再繁殖新孢子；我國現(xiàn)用菌種、種子罐與發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方基本一致，一級種子從孢子開始一直處于同一生長條件生長環(huán)境隨孢子的成長而變化，即始終為菌體生長創(chuàng)造一個有利的環(huán)境；第五十七頁，共八十六頁，2022年，8月28日如培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件出現(xiàn)不可預見的異常因素，孢子比菌球體更能適應；能保持較幼的種齡，前期產(chǎn)酸稍慢，培養(yǎng)基PH>3.0的時間延長，有利淀粉的充分糖化，后期產(chǎn)酸較快，后勁較足，則殘?zhí)禽^低；減少一次接種操作也就減少一次染菌機會，同時節(jié)約了相應設(shè)備的投資及能耗。第五十八頁，共八十六頁，2022年，8月28日孢子直接接種的缺點孢子萌發(fā)期較長，相對延長了發(fā)酵周期，易污染，同時增加了孢子在發(fā)酵罐生長期的攪拌功率消耗，增加了生產(chǎn)成本；孢子接種量大，因為孢子接種量大，則發(fā)酵液中菌體成球數(shù)量多，菌球直徑小，發(fā)酵速度快，產(chǎn)酸水平高，發(fā)酵周期相對縮短；發(fā)酵前期，容易染菌，一旦發(fā)現(xiàn)染菌，或菌種出現(xiàn)質(zhì)量問題，則培養(yǎng)基必須重新滅菌；第五十九頁，共八十六頁，2022年，8月28日第六十頁，共八十六頁，2022年，8月28日（b）菌絲體（種子罐）接種

黑曲霉孢子先經(jīng)種子罐培養(yǎng)后得到產(chǎn)酸型液體菌絲體，然后再接入發(fā)酵罐的接種方式。

第六十一頁，共八十六頁，2022年，8月28日種子罐接種的優(yōu)點：縮短生產(chǎn)罐的發(fā)酵時間，從而提高了設(shè)備利用率。雖然增加了種子罐，但種子罐總?cè)萘啃?，總投資少；種子培養(yǎng)質(zhì)量容易控制，如果直接接種孢子到生產(chǎn)罐中，相當于在生產(chǎn)罐中進行種子培養(yǎng)，由于受發(fā)酵條件制約，生產(chǎn)罐中的營養(yǎng)物不能過多，往往不能滿足孢子發(fā)芽和生長的需要，因此種子發(fā)育緩慢。而在種子罐中可以添加適量營養(yǎng)物以促進種子快速發(fā)育，并可提高其產(chǎn)酸能力；第六十二頁，共八十六頁，2022年，8月28日總能耗降低，因為種子罐單獨培養(yǎng)時，種子罐小，通氣、攪拌的動力消耗遠低于生產(chǎn)罐培養(yǎng)；有利于防止雜菌污染。獨立的種子培養(yǎng)車間比發(fā)酵車間小得多，環(huán)境衛(wèi)生容易控制。在種子罐中單獨培養(yǎng)時，接入孢子的密度約是直接接入生產(chǎn)罐的10倍，加上種子發(fā)育快，受感染的可能性大大降低。而且，生產(chǎn)罐接入菌絲體以后，很快進入產(chǎn)酸階段，受感染的可能性也大為減少。如果種子培養(yǎng)發(fā)生問題（菌種退化或染菌）在種子罐中發(fā)現(xiàn)，損失比主發(fā)酵罐中發(fā)現(xiàn)小得多。第六十三頁，共八十六頁，2022年，8月28日種子罐接種的缺點：

菌絲接種產(chǎn)酸低于孢子直接接種；菌絲接種時，如果接入發(fā)酵罐的種子內(nèi)存在雜菌，這些雜菌從受到低pH抑制的種子培養(yǎng)基環(huán)境，恢復到自然pH環(huán)境的發(fā)酵液中，正好適宜多數(shù)雜菌繁殖。若生產(chǎn)菌株不能迅速產(chǎn)酸以降低pH，染菌幾率則增大。第六十四頁，共八十六頁，2022年，8月28日9、斜面培養(yǎng)基與菌種傳代的關(guān)系

斜面培養(yǎng)基濃度過高或營養(yǎng)過剩則斜面下端不生孢子或孢子生的細小、菌膜增厚出現(xiàn)皺紋。反之則菌膜變薄、孢子細小。這種斜面菌種屬不良菌種。

薯干發(fā)酵菌種，用薯干粉察氏斜面培養(yǎng)基代替麥芽汁斜面培養(yǎng)基效果較好。第六十五頁，共八十六頁，2022年，8月28日10、麩曲三角瓶菌種的培養(yǎng)工藝

我國仍沿用三角瓶麩曲培養(yǎng)生產(chǎn)菌種孢子的工藝，這是我們發(fā)酵方面落后于國外用干孢子培養(yǎng)器培養(yǎng)干孢子的關(guān)鍵工藝。

麩曲培養(yǎng)基需用大片的白麩皮，質(zhì)輕、蓬松、含淀粉量少，有利于孢子繁殖。第六十六頁，共八十六頁，2022年，8月28日11粘度

在檸檬酸深層發(fā)酵過程中，粘度過高，會導致發(fā)酵液的傳熱性下降，溶氧效率降低，液體流動性差，攪拌動力消耗增加等不利影響，營養(yǎng)物質(zhì)的運輸也會受阻，甚至發(fā)酵不能進行。影響粘度因素有：1、溶質(zhì)的量，多數(shù)溶質(zhì)會使粘度升高；2、氣體（O2、CO2等）含量，氣體使粘度降低；3、菌體濃度、性質(zhì)及形態(tài)，菌體濃度高和擴散性生長使粘度升高，但菌體其他性質(zhì)（如表面電荷、表面吸附物）也會影響到粘度；4、溫度，溫度上升一般會使粘度下降。第六十七頁，共八十六頁，2022年，8月28日12、促進發(fā)酵的其他因素種子罐培養(yǎng)基配方：薯干粉濃度高比濃度低好，最高可到22%；添加0.5%硫酸銨、0.3%尿素或0.3%硝酸銨較好；發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基中不需要添加促進劑和微量金屬離子。氮量要控制適當，過多的氮源則導致菌體“瘋長”而產(chǎn)酸下降。第六十八頁，共八十六頁，2022年，8月28日四、玉米原料發(fā)酵工藝（一）工藝路線

目前我國玉米發(fā)酵檸檬酸基本上有4條工藝路線，但應用最多的是玉米干磨去渣發(fā)酵工藝。（二）工藝中的幾個關(guān)鍵問題1、菌種馴化采用薯干原料的菌種比較粗放，用玉米粉培養(yǎng)基將現(xiàn)有菌株馴化，不難得到優(yōu)良菌株。第六十九頁，共八十六頁，2022年，8月28日2、玉米粉的液化

已知谷類淀粉比薯類淀粉較難液化，谷物直接液化難度更大。因此，要用耐高溫α-淀粉酶，二次噴射液化。3、控制好碳、氮比

發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量控制在0.2%~0.4%之間，目前除玉米深加工工藝外，其他均以添加玉米濾渣，或留出部分不過濾的液化液來平衡碳氮比，一般在10%~20%之間。第七十頁，共八十六頁，2022年，8月28日（三）其他問題

玉米液化液發(fā)酵的其他操作和注意事項與薯干粉發(fā)酵基本相似。由于培養(yǎng)基含渣少，可采用“連消”工藝，對生產(chǎn)更有利。

玉米發(fā)酵液顏色淺，雜質(zhì)含量比薯干少，容易凈化，產(chǎn)品潔白而光亮。（四）玉米粉直接發(fā)酵

新菌種ASP.HZ528具有適應高氮源發(fā)酵的性能，對金屬離子不敏感，直接玉米粉發(fā)酵產(chǎn)酸比Co827高。第七十一頁，共八十六頁，2022年，8月28日第三節(jié)檸檬酸表面發(fā)酵工藝

工藝簡介

表面發(fā)酵工藝設(shè)備投資少，動力消耗低，原料粗放、廉價，生產(chǎn)易控制，全部自動化操作。第七十二頁，共八十六頁，2022年，8月28日一、表面發(fā)酵檸檬酸生產(chǎn)用的微生物（一）生產(chǎn)菌種

在工業(yè)生產(chǎn)上應用的菌種，均為黑曲霉。如黑曲霉UV-6、黑曲霉3939和黑曲霉川檸1~2號。

表面發(fā)酵工藝國內(nèi)外普遍采用干孢子接種，這是保證發(fā)酵穩(wěn)定的重要技術(shù)措施。第七十三頁，共八十六頁，2022年，8月28日（二）干孢子的制備1.干孢子制備工藝流程：菌種沙土保藏試管斜面培養(yǎng)（30℃）培養(yǎng)器液體培養(yǎng)（32~35℃

）干燥（40~50℃無菌空氣）干孢子收集質(zhì)量鑒定合格成品保藏使用前質(zhì)量檢查合格作為表面發(fā)酵用種子。第七十四頁，共八十六頁，2022年，8月28日2、制備干孢子的培養(yǎng)基

干孢子質(zhì)量和產(chǎn)量與培養(yǎng)基的組分有很大關(guān)系。孢子培養(yǎng)基對產(chǎn)酸能力影響不明顯，但對孢子生成量有較大區(qū)別。要獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的干孢子需要對不同菌種進行最適孢子培養(yǎng)基的研究。

國內(nèi)一些工廠黑曲霉UV-6菌的培養(yǎng)基采用糖蜜為碳源，成本低，干孢子收集量較多。但要注意糖蜜質(zhì)量的變化，一般糖廠生產(chǎn)期后期的糖蜜不用于干孢子制備。第七十五頁，共八十六頁，2022年，8月28日3、干孢子制備的主要設(shè)備（a）可拆卸式鋁制培養(yǎng)盤

鋁盤可為橢圓形或長方形，面積可隨干燥柜大小而定，高度約0.12m，在離底部3cm高出平放一篩板。液層高度5cm，孢子先接種于大三角瓶，在無菌條件下移入培養(yǎng)盤，置32~35℃培養(yǎng)至孢子成熟，一般培養(yǎng)5~6d。

第七十六頁，共八十六頁，2022年，8月28日（b）孢子收集器

基本上按吸塵原理自行加工孢子收集器。干孢子液體培養(yǎng)成熟后，將鋁盤微微傾斜，把盤內(nèi)培養(yǎng)液除去，然后置培養(yǎng)盤于干燥柜中，兩端與無菌空氣進出管道相連，通入40℃無菌空氣，干燥3~4h,在無菌條件下使用孢子收集器進行孢子收集。第七十七頁，共八十六頁，2022年，8月28日2.制備干孢子的培養(yǎng)基3.干孢子制備的主要設(shè)備干孢子培養(yǎng)和收集裝置1斜面培養(yǎng)2三角瓶培養(yǎng)3培養(yǎng)盤4無菌空氣5培養(yǎng)柜6接種箱7真空膠管8干孢子收集器9一級截留器10二級截留器11真空泵第七十八頁，共八十六頁，2022