包涵體的形成及處理方法包涵體的成以及理方法1涵體形成的原因(1)表達量過高，研究發(fā)現(xiàn)在表達時很少形成包體，表達量越高容易形成包涵體L。原因可能是合成度太快，以至于有足夠的進度進折疊，二硫鍵不能確配對，過多蛋白的非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)無法達到夠的溶解度等。(2)重組蛋白是大腸菌的異源蛋白，核糖蛋白無法糖基化中問體溶解度下，導致不溶解包體形成]。(3)重組蛋分泌序列的存在阻折疊，導致不對疊分子的產(chǎn)生。(4)重組蛋白的基酸組成，一般來含硫氨基酸越多越易形成包涵體。(5)包涵體形成動學研究表明，包涵是由部分變性的中體聚合而成。因此任何影響中間體穩(wěn)定因素，如p值(pH近蛋白的等電時容易形成包涵)離子強度和度都可以引起蛋白聚合反。(6)在細菌分泌的個階段，蛋白分子間的離子鍵疏水鍵或共價鍵化學作用導致了包涵的形成。有報道認為，豐富培養(yǎng)基有利于活蛋白質(zhì)的表達，當養(yǎng)條件不佳時，容易形包涵體?。

.包涵體的處理包涵體的形成有有利的一面，有不利的一面。利的一面是包涵體形成去除了幾乎全部的細胞內(nèi)可性蛋白質(zhì)。同時因包涵體形成避了蛋白水解酶對表產(chǎn)物的降解而大大高產(chǎn)率，通常其達量可占菌體總白的0～30％，甚至高達％。不利的一面是溶解涵體進行復性折疊過程中需要加變性和去垢劑，而引起蛋白質(zhì)不可逆修飾以及質(zhì)改變，這些試價格昂貴，且復性制作過程不好控制另一方面復性過常伴有蛋白質(zhì)水和沉淀，有些還成異構(gòu)體【s]5。因此復性蛋白質(zhì)工程中最關(guān)、最復雜的問題。涵體的處理一般有下幾個步聚。

.破碎細菌細胞提取包涵體時第一步要裂解細，為了防止在裂細菌的過程中追求白質(zhì)變性，常常采取一些保護措：合適的緩沖體，如磷酸鹽緩沖、Tris緩液、檸檬酸緩沖液加CTGS技文件

.

包涵體的形成及處理方法入保護劑，如原劑DTT(2一巰基蘇糖醇、2一巰基乙醇加防止水解酶作用試劑，如酶的抑制劑、EDTA(乙二胺四乙酸。破菌的方法很多主要包括以下幾：(1)滲透破碎：

.這種方法是在滲條件使細胞溶而破碎。(2)熱交替法：把待碎品投人90

℃左右水中維持分鐘后取出投入浴內(nèi)，可使大部細胞破碎?？捎糜谌〉鞍踪|(zhì)和核酸。

.(3)反復凍融法：把待碎樣品卻到一O℃，凍固后取出，緩慢解凍如此反復制作，胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而細胞脹破導致部細胞及胞內(nèi)的顆破碎，但也可使生活性物質(zhì)失活。這方法雖簡單方便但對溫度變化敏的蛋白質(zhì)卻不宜用。超聲波法：用超聲波儀使細膜上所受張力不均使細胞破碎。根不同待碎樣品采不同頻率，不同進。另外，超聲波處時溶液溫度升高使不耐熱的物質(zhì)活，因此使用時防止溫度升高，除歇開機外，還需人降溫。避免溶液存在氣泡，這樣使蛋白質(zhì)變性【】。(5)溶菌酶處理法：多用于破壞大腸菌等微生物的細胞。在每毫升含億個細胞的懸液中加1min，者室溫作用min，胞就破壞了。.

g至1mg溶菌酶，37

℃

保溫洗滌包涵體洗滌包涵體前8000r／rain，離心15rain，可使多數(shù)包涵體沉淀，可溶性蛋白分離。了除去包涵體上粘的雜質(zhì)，如膜蛋白核酸，利用洗滌洗滌包涵體沉淀常用去污劑Tx一00脫氧膽酸鈉和濃度變性劑如2mol／L尿或鹽酸胍等)洗滌以除去脂，但過高濃度的尿或鹽酸胍會使包涵溶解【

.溶解包涵體包涵體一般只于強的變性劑如素、鹽酸胍，它通過離子間的相互用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和子間的各種化學，使多肽伸展，正十六烷基三基銨氯化物等垢劑，可以破壞蛋白內(nèi)疏水鍵，溶解一包涵體蛋白質(zhì)【另外，對于含半胱氨酸的蛋白質(zhì)分離的包涵體中通常有一些鏈間形成二硫鍵和鏈內(nèi)的活性二硫鍵。還需入還原劑，如琉基醇、二硫基蘇糖(DTT)，常用濃度2～mM

.CTGS技文件

包涵體的形成及處理方法另外，尿素和酸胍屬中強度變劑，易經(jīng)透析和濾除去。它們對包體氫鍵有較強的可逆性變性作用所需濃度尿素～M

，鹽酸胍～7M一般來講，鹽胍溶解力強于尿，它能使尿素不能解的包涵體溶解但缺點是容易使DS—電泳條帶變形【9]尿素的溶解度％～％，其分解的氰酸鹽能導致多鏈的自由氨基甲?；瑒e是在堿性p值下長期保溫，但用尿素溶解有不電離，呈中，成本低，蛋白質(zhì)復性后除尿素不會造成大蛋白質(zhì)沉淀，以溶解的包涵體可選多種色譜法純化等點，故目前已被泛采用。

.復性包涵體蛋由于包涵體中重組蛋白缺乏生學活性，加上劇的處理條件，使蛋的高級結(jié)構(gòu)破壞，因此重組蛋白復性特別必要。過緩慢去除變性使目標蛋白從變性完全伸展狀態(tài)恢復正常的折疊結(jié)構(gòu)同時去除還原劑二硫鍵正常形成~1。一般在尿素度M左右時復性開始，到2M右時結(jié)束。對鹽酸胍而言，從M

開始，到．5M時復性過程結(jié)。包涵體蛋的復性是一個非常雜的過程，除與控蛋白質(zhì)復性的過相關(guān)外，還在很大程上與蛋白質(zhì)本身性質(zhì)有關(guān)，有些白非常容易復性，較寬松的條件下復效率可以達到％以上，而有一些蛋白至今有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ湫袕托缘姆椒?，很蛋白的復性效率只有百分之，一般說來，蛋質(zhì)的復性效率在％左右【l2]。

.復性中常采用方法有以下幾種(1)稀釋復性法，直接加入水或緩液，放置過夜，缺是體積增加較大變性劑稀釋速度快，不易控制【。(2)析復性法，好是不增加體積，過逐漸降低外透濃度來控制變性去除速度，有人易形成沉淀，且不合大規(guī)模制作，無應用到生產(chǎn)規(guī)模1。(3)超復性，在生產(chǎn)較多使用，規(guī)模較，易于對透析速度行控制，缺點是