實驗一培養(yǎng)基的制備和滅菌一、目的要求1掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。2學(xué)習(xí)高壓滅菌鍋的操作方法。二、基本原理乳糖蛋白胨培養(yǎng)液:將10g蛋白胨、3g牛肉膏、g乳糖和5g氯化鈉加熱溶解于lOOOmL蒸餾水中，調(diào)節(jié)溶液pH為7.2?7.4,再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL,充分混勻，分裝于試管中，于121°C高壓滅菌器中滅菌15min,貯存于冷暗處備用。高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點增高，得到高于100C的溫度，導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三:一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固；二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。紫外線滅菌是用紫外線燈進行的，紫外線殺菌機制主要是因為它誘導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成，從而抑制了DNA的復(fù)制；由于輻射能使空氣中的氧電離成［0］再使02氧化生成臭氧03或使水H20氧化生成過氧化氫H202,03和H202均有殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以，只適用于無菌室、接種箱的空氣及物體表面的滅菌。三、器材天平，高壓蒸汽滅菌鍋，電烘箱，lmol/LNa0H,lmol/LHCl，培養(yǎng)皿，試管，吸管，酒精燈，三角燒瓶，燒杯，量筒，玻棒，接種環(huán)，牛角匙,pH試紙（pH5.5—9.0），棉花，紗布，牛皮紙，記號筆，麻繩。四、操作步驟1．稱量（1） 乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)溶液pH為7.2?7.4,再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL（2） 細菌培養(yǎng)液：蛋白胨10g/L；酵母5g/L；氯化鈉10g/L；加蒸餾水定容至1L。（3） 細菌加銅培養(yǎng)液:在細菌培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上加入終濃度分別為0、100、200、300的銅。2． 溶化在上述燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。待藥品完全溶解后，補充水分到所需的總體積。3．調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入Imol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH值，直至pH達7.6。反之，則用1mol/LHCl進行調(diào)節(jié)。注意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)，否則，將會影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。對于有些要求pH值較精確的微生物，其PH的調(diào)節(jié)可用酸度計進行。4．分裝按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)（見圖1—1）。分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝試管，其裝量

6.包不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面；分裝三角瓶的量以不超過容積達一半為宜。6.包5．加塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。應(yīng)使棉塞長度的1/3在試管口外，2/3在試管口內(nèi)。扎加塞后，將全部試管用橡皮筋捆扎好，再在棉塞外保一層牛皮紙或報紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用橡皮筋扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱，日期。7.滅菌（1） 首先將內(nèi)層滅菌筒取出，再向外層鍋加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜（2） 放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞，（3） 加蓋，將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓。（4） 通電加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升，當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。（5） 滅菌所需時間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至0時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。8.擱置斜面圖1-2擱置斜面將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50°C左右，將試管棉塞端擱在木條上（見圖I—圖1-2擱置斜面圖1-3接種工具9.倒平板將培養(yǎng)基溶化，待冷至55—60C時，將幾種培養(yǎng)基分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿。手持法（見圖I-5）：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶，置火焰旁，左手拿平皿并松動試管塞或瓶塞，用手掌邊緣和小指、無名指夾住拔出。如果試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)基一次可用完，則管塞或瓶塞不必夾在手指中。瓶口在火焰上滅菌，左手將培養(yǎng)皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml,加蓋后，輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待凝后即可成平板。皿架法（見圖1-4）：將平皿疊放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夾住管塞并打開培養(yǎng)皿，再注入培養(yǎng)基，搖均后制成平板。

454510.無菌試驗將已滅菌的培養(yǎng)基，置無菌試管內(nèi)，放在3VC孵箱中培養(yǎng)2