結(jié)核性腦膜炎臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷現(xiàn)狀和進(jìn)展第一頁，共二十八頁，2022年，8月28日全球每年結(jié)核病新增900萬例，每年有170萬例結(jié)核病患者死亡中國(guó)有超過450萬例結(jié)核病患者，居世界第二截止2011年，耐多藥結(jié)核病已有31萬例，全世界約有200萬人潛伏感染并可能復(fù)發(fā)診斷由是否為結(jié)核分枝桿菌上升到鑒別是否為耐藥或潛伏感染的問題目前現(xiàn)狀第二頁，共二十八頁，2022年，8月28日結(jié)核性腦膜炎（TBM）是由結(jié)核分枝桿菌（Mtb）感染引起的非化膿性細(xì)菌性腦膜炎在肺外結(jié)核中診斷難度、病死率、致死率均最高同齡階段結(jié)核病患者中兒童TBM占20-45%，成人只占2.9-5.9%TBM早期臨床表現(xiàn)、腦脊液變化、影像學(xué)均不典型，腦脊液收集有限，Mtb是細(xì)胞內(nèi)寄生菌，故很多檢測(cè)TBM的方法敏感度低、特異度不高、易誤診、漏診。目前，尚無一種方法可完全解決TBM診斷的問題第三頁，共二十八頁，2022年，8月28日1臨床表現(xiàn)頭痛、易激惹、嘔吐、發(fā)熱、頸項(xiàng)強(qiáng)直、癲癇、局部神經(jīng)損害表現(xiàn)、意識(shí)改變、昏睡一、臨床診斷第四頁，共二十八頁，2022年，8月28日2腦脊液約1/3不典型多數(shù)壓力高，達(dá)200-400mmH2O

無色透明，渾濁或出現(xiàn)薄膜已不常見；細(xì)胞數(shù)多在50-500×10-6/L,也可顯著增高（＞1000×10-6/L）的患者腦脊液中可檢測(cè)到抗酸桿菌分類：早期中性粒細(xì)胞明顯增高，恢復(fù)期以淋巴為主蛋白含量多在1-3g/L60%以上葡萄糖低于正常第五頁，共二十八頁，2022年，8月28日3影像學(xué)檢查無特征性，可為腦積水、腦梗死、腦膜增厚及腦結(jié)核瘤等多種形式頭CT早期主要為滲出性，可見腦膜強(qiáng)化。后期主要為阻塞性腦積水頭MRI，較CT敏感，尤其是波及腦膜或腦干時(shí)第六頁，共二十八頁，2022年，8月28日分為直接病原學(xué)檢查和間接病原學(xué)檢查最新國(guó)際TBM診斷標(biāo)準(zhǔn)：腦脊液中鏡檢到抗酸桿菌、分離培養(yǎng)到Mtb或PCR法檢測(cè)到Mtb，可確診TBM患者腦脊液Mtb載量較低、敏感度明顯低于顱外結(jié)核，尤其是肺結(jié)核二、病原學(xué)檢查第七頁，共二十八頁，2022年，8月28日直接涂片法離心濃縮法漂浮集菌涂片法1抗酸桿菌涂片、染色、鏡檢第八頁，共二十八頁，2022年，8月28日萋尼染色法（Ziehl-Neelsenstain)傳統(tǒng)方法、應(yīng)用最普遍、敏感度低只有腦脊液Mtb數(shù)量超過1000×10-6/L時(shí)才能檢測(cè)到第九頁，共二十八頁，2022年，8月28日改良抗酸染色法：通過玻片離心法保留細(xì)胞的完整性，在萋尼染色同時(shí)使用去垢劑Triton，提高細(xì)胞通透性，從而顯著提高細(xì)胞內(nèi)外Mtb檢出率，敏感度更高僅需0.5ml腦脊液，操作簡(jiǎn)便易行，對(duì)形態(tài)多變、細(xì)胞壁部分或完全缺失的L型Mtb無法著色不能區(qū)分Mtb和非Mtb第十頁，共二十八頁，2022年，8月28日發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LED-FM）觀察“0”-羅丹明染色較普通顯微鏡放大2-4倍不需油鏡可顯著提高檢測(cè)涂片時(shí)間，敏感度更高WHO建議取代傳統(tǒng)的萋尼染色法，是抗酸桿菌研究的發(fā)展方向費(fèi)用昂貴，目前只在發(fā)達(dá)國(guó)家普遍使用第十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)可鑒別Mtb和非Mtb、Mtb分型、藥敏試驗(yàn)、藥物研究Mtb培養(yǎng)第十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日1羅氏（Lownstein-Jenson)培養(yǎng)法應(yīng)用最普遍，敏感度約20%，需時(shí)4-8周2MGIT（mycobateriagrowthindicatortube)液體960培養(yǎng)法近年研究新方法，敏感度約50%，平均14.4天，最快10天。操作簡(jiǎn)單、靈敏，全封閉非侵襲性檢測(cè)系統(tǒng)防止交叉污染，是目前結(jié)核培養(yǎng)的主要發(fā)展方向通過連續(xù)檢測(cè)接種標(biāo)本培養(yǎng)基所顯示的熒光強(qiáng)度變化來判斷是否有分枝桿菌生長(zhǎng)第十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日檢測(cè)Mtb特異核酸片段或抗原成分有助于結(jié)核病診斷和對(duì)Mtb分型快速、高效，可發(fā)展成為全自動(dòng)化檢測(cè)手段目前診斷TBM領(lǐng)域發(fā)展最快的方向。三、病原學(xué)間接檢查第十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日1聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）多用于實(shí)驗(yàn)研究，非臨床診斷最新制定的TBM臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)將商業(yè)化的PCR檢測(cè)試劑盒作為TBM診斷的金標(biāo)準(zhǔn)成本高，敏感度低，尚未作為TBM的常規(guī)檢查（一）核酸檢測(cè)第十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日（1）經(jīng)典PCR檢測(cè)選擇性的擴(kuò)增腦脊液中Mtb的DNA片段常用的靶基因有IS6100保守片段、MPB64抗原、相對(duì)分子質(zhì)量65000蛋白等所需腦脊液量少，敏感度48-100%，特異度84-98%各實(shí)驗(yàn)室所用的靶基因、引物、反應(yīng)條件、報(bào)道的敏感度和特異度差異較大，因此，難以對(duì)TBM的診斷效率進(jìn)行整體評(píng)估第十六頁，共二十八頁，2022年，8月28日（2）GeneXpert:通過對(duì)Mtb特有序列的rpob基因和利福平耐藥相關(guān)81bp的核心區(qū)域進(jìn)行檢查，采用獨(dú)特的定量PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)和全自動(dòng)樣品處理純化核酸敏感度92%，特異度99.6%，2小時(shí)可檢測(cè)8個(gè)樣本操作安全，方法簡(jiǎn)便，樣品使用量小可用于腦脊液、胸腔積液、腹水、膿、糞便標(biāo)本中的MTB檢測(cè)歐美國(guó)家已普遍受到認(rèn)可第十七頁，共二十八頁，2022年，8月28日（3）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法對(duì)靶基因的6個(gè)特異部位設(shè)定4種引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，使靶基因高效擴(kuò)增，應(yīng)用專門的濁度儀進(jìn)行定時(shí)定量檢測(cè)。準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、需時(shí)短、耗材少敏感度88.23%，特異度80%由于敏感度高，極易污染，會(huì)產(chǎn)生假陽性第十八頁，共二十八頁，2022年，8月28日（4）線性探針技術(shù)運(yùn)用多重PCR擴(kuò)增和和反向雜交技術(shù)，通過檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥相關(guān)基因rpoB、katC、inhA的突變敏感度94.3%，特異度96.0%用于早期耐藥結(jié)核病的診斷操作復(fù)雜，費(fèi)用昂貴，不易普及第十九頁，共二十八頁，2022年，8月28日（5）基因芯片技術(shù)將多種探針固定在玻璃等基片上，與待測(cè)樣本的DNA或RNA進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度而進(jìn)行大規(guī)模遺傳差異分析可用于結(jié)核菌種鑒定和Mtb耐藥基因診斷快速標(biāo)本中細(xì)菌數(shù)超過10000個(gè)才能呈現(xiàn)雜交陽性反應(yīng)敏感度低，特異度高第二十頁，共二十八頁，2022年，8月28日將特異度高的DNA探針與敏感度高的PCR技術(shù)結(jié)合，是結(jié)核病研究和臨床應(yīng)用的一種良好途徑第二十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日（1）腦脊液結(jié)核抗原不同種類的結(jié)核抗原純度和活性差異很大，因此，檢測(cè)效果差異較大截至目前，人們使用過的結(jié)核抗原有20余種卡介苗抗原和其他細(xì)菌有交叉反應(yīng)，假陽性率較高2抗原檢測(cè)第二十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日目前最常檢測(cè)的結(jié)核抗原包括結(jié)核菌素純蛋白衍生物、阿拉伯甘露聚糖（LAM）、早期分泌性抗原靶6（ESAT-6）蛋白抗原b、分泌蛋白MPT64、Mtb8.4、Mtb8、Mtb16.3、A60抗原、Ag85復(fù)合體、培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP10等檢測(cè)方法：凝聚試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫斑點(diǎn)法和免疫金標(biāo)技術(shù)第二十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日對(duì)阿拉伯甘露聚糖（LAM）的檢測(cè)已經(jīng)進(jìn)入臨床診斷，有特異的LAM-IgG試劑盒，稱作結(jié)明試驗(yàn)。操作簡(jiǎn)便，20分鐘可出結(jié)果不但可用來診斷TBM，還可以區(qū)分潛伏感染、現(xiàn)癥感染、感染Mtb的毒力第二十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日（2）胞內(nèi)結(jié)核抗原Mtb是胞內(nèi)寄生菌使用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)腦脊液細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核特異性抗原與腦脊液循環(huán)結(jié)核抗原檢測(cè)相比，敏感度可高達(dá)72.5-100.0%，特異度達(dá)90.7%第二十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日（3）二維膠內(nèi)差異凝膠電泳已廣泛應(yīng)用于各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病可鑒別出TBM腦脊液中表達(dá)的特異性蛋白Mtb蛋白花生四烯酸-5-脂氧合酶（ALOX-5）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、抗凝血酶Ⅲ可特異性升高，載脂蛋白E以及A-I、甲狀腺素運(yùn)載蛋白可特異性降低ALOX-5可作為診斷TBM的標(biāo)志性蛋白，如與質(zhì)譜分析聯(lián)合使用，可提高檢出率第二十六頁，共二十八頁，2022年，8月28日1腦脊液結(jié)核抗體血清中IgG抗體水平與病變程度呈正相關(guān)檢測(cè)血清中IgG抗體水平對(duì)于活動(dòng)性疾病的診斷有重要意義患者免疫力低下或長(zhǎng)期使用免疫抑制劑可出現(xiàn)假陰性一次檢測(cè)不能區(qū)分急性和既往結(jié)核感染四、免疫學(xué)檢測(cè)第二十七頁，共二十八頁，2022年，8月28日2結(jié)核菌素試驗(yàn)是結(jié)核病初篩的主要方法之一常用的是芒圖（Mantoux）氏法，即將OT或PPD(純蛋白衍生物purifiedproteinderivative，PPD）用無菌生理鹽水稀釋成不同