一、引物設(shè)計:1,選擇合適的載體。酶切位點及其順序（酶切位點的順序一定不能顛倒）。2，在NCBI上再次確認(rèn)目的片段的堿基序列，進(jìn)行primerblast，確定其特異性。使用primer5排除目的片段里含有的酶切位點，或利用其本身含有的酶切位點，最后確定所使用的酶。首位20個堿基上游酶切位點保護(hù)堿基1個設(shè)計引物：primer-up起始密碼子閱讀框無移碼：首位20個堿基上游酶切位點保護(hù)堿基1個起始密碼子閱讀框無移碼末尾20個堿基的反向互補堿基下游酶切位點保護(hù)堿基1個Primer-down終止密碼子，整個無移碼：-----------末尾20個堿基的反向互補堿基下游酶切位點保護(hù)堿基1個終止密碼子，整個無移碼核對----送公司合成。對公司合成的引物離心，10000rpm、5-10分鐘、at4℃，在超凈臺按照管子上標(biāo)注的體積加入1*TE，為100uM，再用ddH2O稀釋成10uM，-30℃保存。二、PCR（）：（一）、引物Tm值titrate：pcr（15ul小體系）Sence：0.3ul一般titrate5個溫度值，并設(shè)一Antisence：0.3ul個NC（不加template）DNTP：0.3ulcDNA一般為Hela或293TTaq：0.1ul10*buffer：1.5ulTemplate（cDNA）：1ulH2O：11.5ul（二）、pcr（50ul大體系）Sence：1ulTm溫度用titrate時得到的條帶Antisence：1ul最亮的溫度DNTP：1ulTaq：0.5ul10*buffer：5ulTemplate（cDNA）：2ulH2O：39.5ul三、跑膠，膠回收:1.2%的瓊脂糖膠：大膠孔1、1.2%的瓊脂糖膠：大膠孔煮沸3次稱1.2g的瓊脂糖煮沸至少三次至無肉眼可見沉淀凝膠塊煮沸3次煮沸至少三次至無肉眼可見沉淀凝膠塊加入100ml的1XTAE（視plasmid大小不同膠的濃度不同，plasmid越小膠濃度越大）膠凝固后，即可點樣跑膠。2、跑膠：120V、40min。3、泡EB溶液20min后，紫外燈下觀察，切膠（要帶防護(hù)手套和口罩）4、做膠回收:（1）加入400ul溶膠液，55℃溶膠；（2）待膠全溶后，過膠回收柱，12000rpm，1min；（3）DNAWashBuffer500ul，12000rpm，1min，twice；（4）開蓋離心，15min；（5）換新的1.5mlEP管，加ElutionBuffer30ul，12000rpm，1min，重復(fù)吸取，12000rpm，1min；（ElutionBuffer使用前65℃溫?zé)幔?）測濃度四、連接：2xBuffer5ul10ul的體系TVector0.5ul16℃水浴過夜Insert4ulInsert的量應(yīng)用ug數(shù)統(tǒng)計Insert的量應(yīng)用ug數(shù)統(tǒng)計Lignase0.5ul若insert濃度較大，應(yīng)加的量小于4ul，則其余部分用水補齊。五、連接轉(zhuǎn)化：感受態(tài)DH5α感受態(tài)DH5α100ul連接產(chǎn)物10ul（1）、冰上20min→熱激：42℃、1min30s→冰上20min；（2）、加500ulSOC（或者500ulLB），37℃、220rpm、1h；（3）、平板提前取出提前放37℃恒溫箱預(yù)熱，取100ulIPTG+50ulX-Gal，混勻，涂板，正置于37℃恒溫箱吸收；（4）、將上述轉(zhuǎn)化后的菌液涂板（根據(jù)載體抗性不同涂不同的抗性板）；（5）、37℃恒溫培養(yǎng)箱，倒置過夜。六、挑菌：4mlLB+一定比例抗生素（與平板抗生素一致，取決于載體對應(yīng)的抗生素，Amp比例為1:1000，Kana比例為1:200），用黃槍頭挑取單菌落，于試管中吹懸，灼燒瓶口及試管塞，37℃，220rpm，震蕩過夜（至菌液渾濁不透明）。一般挑5-6管七、菌液PCR（15ul體系）Sence：0.3ul加一PC，用以前連T成功的Antisence：0.3ulplasmidDNTP：0.3ul使用T載體的通用引物T7、Sp6Taq：0.1ul10*buffer：1.5ulTemplate（菌液）：1ulH2O：11.5ul跑DNA膠驗證，取條帶位置正確的提取質(zhì)粒。八、質(zhì)粒小提1、菌液于2mlEP管內(nèi)離心，12000rpm，2min；2、棄上清，加溶液Ⅰ250ul吹懸沉淀；3、加溶液Ⅱ250ul，輕輕搖晃10次，靜置5min；4、加溶液Ⅲ350ul，震蕩5次，冰上靜置1min；5、離心，12000rpm，15min；6、將上清過柱，12000rpm，1min；7、漂洗液700ul過柱，12000rpm，1min；8、漂洗液500ul過柱，12000rpm，1min；9、開蓋離心，12000rpm，15min；10、換新的1.5mlEP管，加60ul洗脫液，12000rpm，1min，重復(fù)洗脫一次。11、測濃度。九、質(zhì)粒PCR（15ul體系）Sence：0.3ulAntisence：0.3ulDNTP：0.3ul使用特異性引物Taq：0.1ul10*buffer：1.5ulTemplate（plasmid）：0.5ulH2O：12ul跑DNA膠驗證，取條帶位置正確的做酶切。十、酶切（10ul小體系酶切）ControlXholBamHⅠX-BBuffer1111Palsmid200ngXhol-0.2-0.2BamHⅠ--0.20.2H2O補足至10ul37℃2h跑DNA膠驗證，若切全了且位置正確，則送測序。十一、測序結(jié)果blast通過NCBI對測序結(jié)果進(jìn)行blast，若沒有突變或者沒有有義突變，沒有缺失，則沒有閱讀框的移碼，酶切位點方向與類別均正確，起始子終止子正確，進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，大體系酶切。沒有閱讀框的移碼，酶切位點方向與類別均正確，起始子終止子正確，十二、質(zhì)粒擴(kuò)增感受態(tài)DH5α感受態(tài)DH5α10ulPlasmid1ul（50ng）（1）、冰上15min→熱激：42℃、1min30s→冰上2min；（2）、加100ulSOC（或者100ulLB），37℃、220rpm、30h；（4）、1ul培養(yǎng)液+100ulSOC（或LB）涂板（根據(jù)載體抗性不同涂不同的抗性板）；（5）、37℃恒溫培養(yǎng)箱，倒置過夜。十三、酶切（一）、10ul小體系酶切驗證（與第十步體系相同）（二）、60ul大體系酶切（insert、vector）ControlX-BBuffer6ul6ulPalsmid100ng5ugXhol-1ulBamHⅠ-1ulH2O補足至60ul37℃3h在酶切到2h30min時，取10ul酶切溶液跑DNA電泳已確認(rèn)是否切全，insert：若未切全，可補1/4的酶繼續(xù)切半個小時；若已切全，則可將剩余酶切液跑電泳，切膠，膠回收。Vector：若未切全，可補1/4的酶繼續(xù)切半個小時；若已切全，則加1ulCIAP酶繼續(xù)切處理CIAP酶的作用是除去磷酸基團(tuán)，降低載體自連30min，然后將酶切液跑電泳，切膠，膠回收。處理CIAP酶的作用是除去磷酸基團(tuán)，降低載體自連十四、切膠，膠回收與第三步相同十五、連接10xBuffer1ul10ul的體系Vector0.5ul16℃水浴過夜Insert4ulT4DNALignase1ulVector與insert的質(zhì)量比為5:3物質(zhì)量比，即摩爾比，載體：insert=1：#物質(zhì)量比，即摩爾比，載體：insert=1：#若insert濃度較大，則其余部分用水補齊。十六、連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α100ul感受態(tài)DH5α100ul連接產(chǎn)物10ul（1）、冰上20min→熱激：42℃、1min30s→冰上20min；（2）、加500ulSOC（或者500ulLB），37℃、220rpm、1h；（3）、將上述轉(zhuǎn)化后的菌液涂板（根據(jù)載體抗性不同涂不同的抗性板）；（4）、37℃恒溫培養(yǎng)箱，倒置過夜。十七、挑菌：4mlLB+一定比例抗生素（與平板抗生素一致，取決于載體對應(yīng)的抗生素，Amp比例為1:1000，Kana比例為1:200），用黃槍頭挑取單菌落，于試管中吹懸，灼燒瓶口及試管塞，37℃，220rpm，震蕩過夜（至菌液渾濁不透明）。一般挑5-6管十八、菌液PCR（15ul體系）Sence：0.3ul加一PC，用以前連該載體成功Antisence：0.3ul的plasmidDNTP：0.3ul使用載體的通用引物Taq：0.1ulpc3.1的通用引物為cmv和bgh10*buffer：1.5ul19b的通用引物為t7和terminaterTemplate（菌液）：1ulH2O：11.5ul跑DNA膠驗證，取條帶位置正確的提取質(zhì)粒。十九、質(zhì)粒小提1、菌液于2mlEP管內(nèi)離心，12000rpm，2min；2、棄上清，加溶液Ⅰ250ul吹懸沉淀；3、加溶液Ⅱ250ul，輕輕搖晃10次，靜置5min；4、加溶液Ⅲ350ul，震蕩5次，冰上靜置1min；5、離心，12000rpm，15min；6、將上清過柱，12000rpm，1min；7、漂洗液700ul過柱，12000rpm，1min；8、漂洗液500ul過柱，12000rpm，1min；9、開蓋離心，12000rpm，15min；10、換新的1.5mlEP管，加60ul洗脫液，12000rpm，1min，重復(fù)洗脫一次。11、測濃度。二十、質(zhì)粒PCR（15ul體系）Sence：0.3ulAntisence：0.3ulDNTP：0.3ul使用特異性引物Taq：0.1ul10*buffer：1.5ulTemplate（plasmid）：0.5ulH2O：12ul跑DNA膠驗證，取條帶位置正確的做酶切。二十一、酶切ControlXholBamHⅠX-BBuffer1111Palsmid200ngXhol-0.2-0.2BamHⅠ--0.20.2H2O補足至10ul37℃2h跑DNA膠驗證，若切全了且位置正確，則送測序。二十二、測序比對通過NCBI對測序結(jié)果進(jìn)行blast，若沒有突變或者沒有有義突變，沒有缺失，則擴(kuò)增一批質(zhì)粒后，構(gòu)建到表達(dá)載體中PC3.1也是表達(dá)載體，是哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)載體。PC3.1也是表達(dá)載體，是哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)載體二十三、構(gòu)建到表達(dá)載體（一）、將plasmid轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)載體BL21BL21是大腸桿菌宿主細(xì)胞，不是表達(dá)載體BL21是大腸桿菌宿主細(xì)胞，不是表達(dá)載體感受態(tài)BL2110ul感受態(tài)BL2110ulPlasmid1ul（1）、冰上15min→熱激：42℃、1min30s→冰上2min；（2）、加100ulSOC（或者100ulLB），37℃、220rpm、30min；（3）、5ul菌液+100ulSOC（或100ulLB）涂板（根據(jù)載體抗性不同涂不同的抗性板）；（4）、37℃恒溫培養(yǎng)箱，倒置過夜。（二）、挑菌（早上挑）2.5ml2xYT（或者LB）+一定比例抗生素（Amp1:1000、Kana1:200這里最好用終濃度表示，黑本夾子上有配方，根據(jù)配方ug/ml計算出最終加的量），37℃，220rpm這里最好用終濃度表示，黑本夾子上有配方，根據(jù)配方ug/ml計算出最終加的量（三）、小樣誘導(dǎo)1、待菌液微渾濁時取出，取300ul菌液加200ul50%甘油，封口膜封口于-80℃凍存。再需要用時取出，溶化后直接劃線即可。2、取300ul菌液，離心12000rpm，1min，棄上清，沉淀用90ul水吹勻，加30ul4xSDS，95℃煮10min，誘導(dǎo)前樣品即備好。3、剩余1.4ml菌液，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)（有兩種誘導(dǎo)條件）1:200同樣，終濃度220rpm37℃常溫誘導(dǎo)4h同樣，終濃度1:1000180rpm25℃低溫誘導(dǎo)16h4、誘導(dǎo)完成后，取300ul菌液，離心12000rpm，1min，棄上清，沉淀用90ul120ul水吹勻，加30ul40ul4xSDS，95℃煮10min，誘導(dǎo)后樣品即備好。120ul40ul5、剩余菌液離心12000rpm，2min，棄上清，沉淀用100ul水吹勻，20%功率1s1s超聲2min左右，至菌體均勻澄清，離心12000rpm，5min，取上清90ul，加30ul4xSDS，95℃煮10min，上清樣品即備好；剩余上清棄掉，沉淀用120ul水吹勻，加40ul4xSDS，95℃煮10min，沉淀樣品即做好。6、先跑考染驗證蛋白是否誘導(dǎo)出，然后跑westernblot驗證抗體驗證誘導(dǎo)出的條帶是否為特異性蛋白是否好用。驗證誘導(dǎo)出的條帶是否為特異性蛋白7、上樣順序及上樣量：前后清沉105105（ul）（四）、大樣誘導(dǎo)1、將之前的保種菌液取出劃線，37℃，倒置過夜；2、2.5ml2xYT（或者LB）+一定比例抗生素，搖菌，待微微渾濁后，倒進(jìn)含抗生素的200ml2xYT（或者LB）里，37℃，220rpm，振蕩培養(yǎng)，期間注意觀察測量使其OD值在0.4-0.6之間為止；3、取500ul菌液作