柱層析固相萃取和制備色譜第一頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日分析過(guò)程中各步驟花費(fèi)的時(shí)間樣品前處理61%采樣6%分析6%數(shù)據(jù)處理27%第二頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日分離與富集分離（separation）的概念分離是一種假設(shè)狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，不同的物質(zhì)被分開(kāi)了（isolation）。含有m種化學(xué)組分的混合物被分成m個(gè)常量范圍。把m種化學(xué)組分分成m種純的形式，并把它們置于m個(gè)獨(dú)立的容器中。利用混合物中各組分在物理或化學(xué)性質(zhì)上的差異，通過(guò)適當(dāng)?shù)难b置或方法，使各組分分配至不同的空間區(qū)域或者在不同的時(shí)間依次分配至同一空間區(qū)域的過(guò)程。第三頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日富集（concentration）的概念：在分離的過(guò)程中使對(duì)象物質(zhì)在某空間區(qū)域的濃度增加。從大量基體物質(zhì)中將欲測(cè)量的組分集中到一較小體積的溶液中，從而提高檢測(cè)靈敏度。

分離與富集的關(guān)系：富集需要借助分離的手段，在分析過(guò)程中分離與富集往往是同時(shí)實(shí)現(xiàn)的。富集與分離的目不同，富集只是分離的目的之一。第四頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日柱層析法（柱色譜）柱色譜概述常用柱色譜介質(zhì)的分類柱色譜操作流程第五頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日柱色譜---概述

吸附柱層析是利用吸附劑對(duì)混合試樣各組分的吸附力不同而使各組分分離。

當(dāng)采用溶劑洗脫時(shí)，發(fā)生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的過(guò)程，吸附力較強(qiáng)的組分，移動(dòng)的距離小，后出柱；吸附力較弱的組分，移動(dòng)的距離大，先出柱。第六頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日常用柱色譜介質(zhì)的分類無(wú)機(jī)物色譜介質(zhì)

氧化鋁、硅膠、活性炭、膨潤(rùn)土、磷酸鈣(凝膠型和晶型)、氧化鈦和氫氧化鋅凝膠等。聚合物色譜介質(zhì)

瓊脂糖、葡聚糖、纖維素和聚丙烯酰胺等。

第七頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日柱色譜---吸附劑氧化鋁

市售的層析用氧化鋁有堿性、中性和酸性三種類型，粒度規(guī)格大多為100～150目。堿性氧化鋁（pH9-10）：適用于堿性物質(zhì)（如胺、生物堿）和對(duì)酸敏感的樣品（如縮醛、糖苷等），也適用于烴類、甾體化合物等中性物質(zhì)的分離。

酸性氧化鋁（）：適用于酸性物質(zhì)如有機(jī)酸、氨基酸等以及色素和醛類化合物的分離。

中性氧化鋁（pH7-7.5）：適用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定的物質(zhì)如酯、內(nèi)酯等的分離，也可以用來(lái)分離弱的有機(jī)酸和堿等。

第八頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日層析用硅膠為一多孔性物質(zhì)，分子中具有硅氧烷的交鏈結(jié)構(gòu)，同時(shí)在顆粒表面又有很多硅醇基。非極性和極性化合物，適用于芳香油、萜類、甾體、生物堿、強(qiáng)心甙、蒽醌類、酸性、酚性化合物、磷脂類、脂肪酸、氨基酸，以及一系列合成產(chǎn)品如有機(jī)金屬化合物等

吸附劑硅膠柱色譜----吸附劑硅膠第九頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日柱色譜操作流程—裝柱

硅膠浸泡于石油醚中，攪拌均勻后一次性倒入柱中預(yù)先加入溶劑第十頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日敲打均勻緊密柱色譜操作流程—裝柱第十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日柱色譜操作流程—拌樣樣品10mg溶于溶劑中，全溶加拌樣硅膠100－150目1:1-1.5攪拌均勻至干必要時(shí)旋蒸至干第十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日柱色譜操作流程--拌樣溶解攪拌至干第十三頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日柱色譜操作流程--上樣均勻加到柱中第十四頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日柱色譜操作流程---洗脫與接收用不同比例的石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫每個(gè)極性洗脫3－5個(gè)保留體積每個(gè)保留體積接收10－20份餾分整個(gè)過(guò)程加低壓第十五頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日第十六頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日柱色譜操作流程--濃縮濃縮方法溶劑濃縮自然揮干減壓濃縮凍干第十七頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日柱色譜操作流程--薄層鑒定吸附劑：硅膠—CMC展開(kāi)劑：C6H6—EtoAc(3:2或97：9)顯色劑：（1）氨蒸氣熏。（2）5%KOH噴霧第十八頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日制備色譜第一部分.制備HPLC概述第二部分.制備HPLC技術(shù)問(wèn)題上樣條件的選擇循環(huán)色譜柱切換第十九頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日制備HPLC概述制備色譜到底是什么？

結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大、進(jìn)樣量大、采用制備柱；柱后餾分收集器。

第二十頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日制備HPLC概述—

制備HPLC與分析HPLC比較

目的填料流量流通池聯(lián)系制備HPLC樣品中特定成分的高純度獲取，大量、廉價(jià)的制備20μm以上為佳0.1-150ml/min最大允許流速可為150mL/min在進(jìn)行制備HPLC之前，常先進(jìn)行分析HPLC實(shí)驗(yàn)，對(duì)分析方法進(jìn)行優(yōu)化、放大應(yīng)用到制備HPLC中，詳見(jiàn)后。分析HPLC定性分析：檢測(cè)的靈敏度定量分析：分離度、再現(xiàn)性3-5μm0.001-9.999ml/min一般的分析池的最大允許流速僅為5mL/min，或者10mL/min第二十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日制備HPLC概述—主要結(jié)構(gòu)單元輸液部:輸液泵分離部:制備柱檢測(cè)部:檢測(cè)器餾分部:餾分收集器第二十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日制備HPLC概述—對(duì)儀器的要求

制備泵的耐壓

制備HPLC系統(tǒng)因制備柱的填料很細(xì)，分離度好，同時(shí)反壓很高，整個(gè)系統(tǒng)對(duì)壓力很敏感，制備泵要求能在制定的恒流量下,克服100-150bars反壓色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷）

不影響收集物純度時(shí)的最大進(jìn)樣量；一般都超載進(jìn)樣。但進(jìn)樣量超過(guò)柱容量，柱效迅速下降，峰變寬。

超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%為宜。

第二十三頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日制備HPLC概述—分離效能

取決于分離速度、分辨率和上樣量。對(duì)某一個(gè)分離參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化常會(huì)影響到其他分離參數(shù)。分辨率速度載樣量增加洗脫液流速會(huì)降低分辨率，分辨率也會(huì)因上樣量過(guò)大而下降。但分辨能力并不總是制備HPLC首要考慮的因素，制備型HPLC應(yīng)首先具有經(jīng)濟(jì)、快速的生產(chǎn)所需產(chǎn)品的能力。第二十四頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日在許多分離工作中，需要從大量的物質(zhì)中分離純化不足１％的所需成分，這種分離工作十分困難，在純化的最后階段常需使用１０μm或更小顆粒的高效填料。為獲得所需微量組分，可采用如下手段：制備型分離-半制備型分離-分析型分離-產(chǎn)物。

制備HPLC概述—分離效能第二十五頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日制備HPLC有關(guān)技術(shù)問(wèn)題—超量進(jìn)樣

大樣品量的純化方法分析系統(tǒng)的放大:

使用直徑更大的制備柱、更高的流速，根據(jù)色譜柱的長(zhǎng)度增加進(jìn)樣量并保持樣品濃度不變，峰形尖銳而對(duì)稱。需大型的色譜柱和大量的溶劑來(lái)分離較少的樣品，不經(jīng)濟(jì)色譜柱超量載樣：相同的條件下超量進(jìn)樣濃縮法和體積超載法第二十六頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日制備HPLC的首要問(wèn)題是快速、高效的制備色譜純的產(chǎn)品?。》蛛x度不是首要問(wèn)題，色譜峰會(huì)比較難看！第二十七頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日制備HPLC技術(shù)問(wèn)題—組分的收集第二十八頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日制備HPLC技術(shù)問(wèn)題—樣品的初步純化在利用制備HPLC最終純化步驟前做一些初步純化是提高效率降低成本的優(yōu)化措施.

比如最終純化通常有一定的分離難度,又希望有足夠的收率,所以使用的儀器和填料可能是昂貴的.未經(jīng)預(yù)純化的樣品,尤其是天然產(chǎn)物,含有大量的可能在填料表面不可逆吸附的組分,直接進(jìn)樣,可導(dǎo)致昂貴的填料很快失效.此外,大量的雜質(zhì)降低對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物分離度,因此限制了進(jìn)樣量和生產(chǎn)效率.同時(shí)分別用正反相色譜去除前后雜,比單用一種色譜得到目標(biāo)產(chǎn)物更簡(jiǎn)單易行.總之,制備色譜尤其是工業(yè)色譜的目標(biāo)不僅是找到技術(shù)上可行的方法,而且要綜合考慮成本.第二十九頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日

上樣量主要根據(jù)柱子的大小、樣品的濃度和制備是否根據(jù)分析條件放大（例如制備柱是否還用分析用填料）根據(jù)內(nèi)徑計(jì)算：內(nèi)徑放大N倍，進(jìn)樣量大致可放大N平方倍（柱長(zhǎng)一定時(shí)）制備HPLC技術(shù)問(wèn)題—上樣量的選擇將分析色譜上的結(jié)果放大到制備色譜中：

上樣量的調(diào)整：

mp/ma=lp/la*r2p/r2a

L:柱長(zhǎng)；m：進(jìn)樣量；r：色譜柱內(nèi)徑

p:制備柱；a：分析柱第三十頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日制備HPLC技術(shù)問(wèn)題—條件的選擇

從分析方法到制備方法的放大和方法的優(yōu)化需要三個(gè)步驟：

1.優(yōu)化分析方法的選擇性。

2.在分析柱上進(jìn)行超量載樣。

3.放大到制備柱。

線性放大非線性放大第三十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日制備HPLC技術(shù)問(wèn)題—條件的選擇線性放大

指柱直徑、長(zhǎng)度（即柱體積）和流速等可以根據(jù)加樣量的增加情況進(jìn)行按比例線形放大。制備色譜中，最好的線形放大是在其他工藝條件不變的情況下，只改變柱子和流速，就可以放大生產(chǎn)，同時(shí)分離效果保持不變。成本比較大，同時(shí)也大大減少生產(chǎn)的產(chǎn)量和速度非線性放大第三十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日制備HPLC技術(shù)問(wèn)題—條件的選擇流速的調(diào)整梯度洗脫

分離效果取決于梯度的選擇，理論上梯度越小，分辨率越高。在分析上摸好條件，上制備柱往往還要降低一些洗脫液的濃度。柱子再生依次用水，甲醇，四氫呋喃，氯仿，甲醇來(lái)沖洗柱子，每種溶劑5-10個(gè)柱體積。第三十三頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日制備HPLC技術(shù)問(wèn)題—條件的選擇1）制備的目的是在一次操作中盡可能地多上樣，所以，首先得在分析柱上實(shí)現(xiàn)超載，否則，分析柱分離得再漂亮，再在制備柱中線性放大時(shí)就因?yàn)槌杀静缓侠矶粺o(wú)情地否決。2）制備的目的是分離你所關(guān)心的組分，只要它能與其它雜質(zhì)分離的好就行了，所以不要希望在分析柱上先得到所有組分的基線分離，完全沒(méi)有必要！設(shè)計(jì)梯度時(shí)只需對(duì)目的物前后5-10%梯度的范圍進(jìn)行精細(xì)分離。第三十四頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日制備HPLC技術(shù)問(wèn)題—條件的選擇3）制備中常常因?yàn)槌d而無(wú)法使目的物與鄰近雜質(zhì)間達(dá)到基線分離，可以采用分段收集的方法得到指定純度的目的物，要求越純，單次操作的得率也越低。4）制備中因?yàn)槟康奈飦?lái)之不易，常常需要將純度不合格得目的物重新上柱循環(huán)，一般只需稀釋1-2倍就可以了。由于重新上柱是會(huì)增加成本的，所以超載的量要平衡單次操作的純品得量和效益與返工成本，以單位純品數(shù)量進(jìn)行成本核算，以優(yōu)化最佳上樣量。

第三十五頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日固相萃取技術(shù)SPE一.SPE基本原理二.SPE法的優(yōu)點(diǎn)三.SPE裝置四.SPE柱填料類型五.SPE分析方法的建立六.SPE的應(yīng)用第三十六頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日SPE----基本原理定義：利用固相吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫，達(dá)到分離和和富集的目的。分離：雜質(zhì)保留或目標(biāo)化合物保留。富集：目標(biāo)化合物保留，化合物極性與吸附劑極性越接近，保留越強(qiáng)。分離機(jī)理：利用雜質(zhì)或目標(biāo)化合物與樣品基體溶劑和吸附劑之間親和力的相對(duì)大小。第三十七頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日SPE----基本原理SPE也是一個(gè)柱色譜分離過(guò)程，分離機(jī)理、固定相和溶劑的選擇等方面與HPLC有許多相似之處。SPE柱的填料粒徑（>40μm）要比HPLC填料（3-10μm）大。由于短的柱床和大的粒徑，SPE柱效比HPLC色譜柱低得多。SPE只能分開(kāi)保留性質(zhì)有很大差別的化合物。SPE柱是一次性使用。第三十八頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日SPE---優(yōu)點(diǎn)許多分析方法中已經(jīng)替代了液-液萃取

節(jié)省分析時(shí)間

減少有機(jī)溶劑的使用，不污染環(huán)境高效、快速，可同時(shí)處理多個(gè)樣品

提高分析質(zhì)量，減少背景的干擾

提高了回收率固相萃取所需時(shí)間為液－液萃取的1/2，費(fèi)用為液－液萃取的1/5。第三十九頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日SPE柱

最簡(jiǎn)單的固相萃取裝置就是一根直徑為數(shù)毫米的小柱．由醫(yī)用聚丙烯管，多孔篩板，填料三部分組成。小柱可以是玻璃的，也可以是聚丙稀﹑聚乙烯﹑聚四氟乙烯等塑料的，還可以是不銹鋼制成的。

規(guī)格：100mg/1mL，

200mg/3mL，300mg/3mL，

1g/6mL，2g/12mL。。

第四十頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日SPE柱的選擇樣品量萃取柱的大小1ml1ml

1ml-250ml，且不要求萃取速度3ml1ml-250ml，要求快速萃取6ml

10ml-250ml，要求高樣品容量12，20或60ml<1L，且不要求萃取速度12，20或60ml>1L和要求高樣品容量90mm被萃取樣品的質(zhì)量不超過(guò)柱中填料量的5%?。?/p>

第四十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日SPE柱及其配套裝置自然淋洗-----簡(jiǎn)易支架

加正壓-----注射器

加負(fù)壓-----真空裝置

第四十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日SPE常見(jiàn)填料類型

1.硅膠和鍵合硅膠

2.高分子聚合物

3.其他吸附型填料，如氧化鋁、硅藻土

4.混合型或?qū)Ｓ弥盗械谒氖?yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日SPE柱常見(jiàn)填料類型—硅膠表面第四十四頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日SPE常見(jiàn)填料類型—鍵合相硅膠

鍵合相硅膠，是在硅膠表面的硅醇基團(tuán)上鍵合不同的有機(jī)基團(tuán)，如烷基鏈或其它官能團(tuán)，如-OH、-C6H5、-NH2、-CN等。實(shí)際上吸附劑角色是由這些新接上的含官能基碳鏈來(lái)完成。第四十五頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日SPE柱常用填料類型

按保留機(jī)理分為：正相：Silica、NH2、CN、Diol、Florisil（硅酸鎂載體）、Alumina反相：C18、C8、C2、環(huán)己烷基、苯基、CN離子交換：苯丙磺酸SCX、三甲基丙基胺

SAX、COOH、NH2混合型：SCR、SAR第四十六頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日SPE柱操作流程活化吸附劑進(jìn)樣洗滌洗脫第四十七頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日SPE方法的建立—柱預(yù)處理

柱預(yù)處理目的:除去填料中可能存在的雜質(zhì)；使填料溶劑化，提高固相萃取的重現(xiàn)性。填料未經(jīng)預(yù)處理或者未被溶劑濕潤(rùn)，能引起溶質(zhì)過(guò)早穿透，影響回收率。第四十八頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日SPE方法的建立—柱預(yù)處理

SPE預(yù)處理的方法正相類型固相萃取硅膠和極性吸附劑介質(zhì)，通常用樣品所在的有機(jī)溶劑來(lái)預(yù)處理。反相類型硅膠和非極性吸附劑介質(zhì),通常用水溶性有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈、四氫呋喃和丙酮預(yù)處理,然后用水或緩沖溶液。離子交換填料將用于非極性有機(jī)溶劑中的樣品,其用3-5ml的去離子水或低濃度的離子緩沖溶液來(lái)預(yù)處理。

第四十九頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日SPE方法的建立—加樣

預(yù)處理后，試樣溶液被加至并通過(guò)SPE柱。在該步驟，分析物及雜質(zhì)被保留在吸附劑上。

為了防止分析物的流失，試樣溶劑強(qiáng)度不宜過(guò)高。當(dāng)以反相機(jī)理萃取時(shí)，以水或緩沖劑作為溶劑，其中有機(jī)溶劑量不超過(guò)10%（V/V）。第五十頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日SPE方法的建立—洗脫除去干擾雜質(zhì)-Wash用中等強(qiáng)度的溶劑，將干擾組分洗脫下來(lái)，同時(shí)保持分析物仍留在柱上。分析物的洗脫和收集-Elution這一步驟的目的是將分析物完全洗脫并收集在最小體積的組分中，同時(shí)使比分析物保留更強(qiáng)的雜質(zhì)盡可能多地仍留在SPE柱上洗脫溶劑的強(qiáng)度是至關(guān)重要的?。?！第五十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日SPE方法的建立—洗脫

從SPE的操作步驟可以看出，SPE的重現(xiàn)性受多個(gè)因素的影響，實(shí)驗(yàn)條件是影響重現(xiàn)性的主要原因。提高重現(xiàn)性的方法有（1）使用替代物，加入適當(dāng)?shù)奶娲镒鰠⒈龋唬?）加入樣品量適當(dāng)，不超出穿透量和穿透體積；（3）選擇合適的洗滌液和洗脫液，確保分析物在操作中不流失。第五十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，2022年，8月28日SPE方法的建立—選擇合適的