2.3分解纖維素的微生物的分離閱讀課本27頁基礎(chǔ)知識部分第一、二段，回答下列問題：1、纖維素在生物圈的分布狀況？2、纖維素酶的組成及作用？

纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)。植物的根、莖、葉等器官都含有大量的纖維素。其中棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物。一、纖維素和纖維素酶纖維素C1酶Cx酶纖維二糖葡萄糖苷酶葡萄糖商品纖維素：CMC-Na、Avicel纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般至少包括三種組分。纖維素酶的測定方法：對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進(jìn)行定量的測定。①取二支20mL的試管（甲、乙）*實(shí)驗(yàn)：纖維素酶分解纖維素的實(shí)驗(yàn)②各加入一張濾紙條③各加入10mL0.1mol/L的醋酸－醋酸鈉緩沖液甲乙④在甲試管中加入1mL蒸餾水，乙試管加入1mL纖維素酶（70-80U/mL）⑤將試管放在140r/min的搖床上振蕩1h⑥結(jié)果：乙試管的濾紙條消失

討論：乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是什么？二、纖維素分解菌的篩選閱讀課本課本28頁相關(guān)部分，回答下列問題：1、篩選方法2、篩選原理剛果紅染色法：這種方法能夠通過顏色反應(yīng)直接對微生物進(jìn)行篩選。

剛果紅是一種染料，它可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，但并不和纖維二糖、葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后剛果紅—纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈

。這樣我們可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。二、纖維素分解菌的篩選【辨析】挑取哪一種菌落可以獲得高效的纖維素分解菌？ABCDab比值越大，分解效率越高【想一想】加入剛果紅染料后，從功能上看該培養(yǎng)基屬于哪一類培養(yǎng)基？鑒別培養(yǎng)基三、實(shí)驗(yàn)操作土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落想一想：本實(shí)驗(yàn)流程與課題2的實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同？課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。以纖維素為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基（液體）：纖維素分解菌大量增殖以纖維素為唯一碳源的選擇、鑒別培養(yǎng)基（固體）土壤中的纖維素分解菌較少1、土壤取樣取樣的環(huán)境是怎樣的，作出這種選擇的理由是什么？方法一：選擇纖維素豐富的環(huán)境，如樹林中多年落葉形成的表層腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等等。提示：在尋找目的菌株時(shí)，要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。想一想：為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？該環(huán)境下纖維素分解菌的含量較高。1、土壤取樣取樣的環(huán)境是怎樣的，作出這種選擇的理由是什么？方法二：將濾紙埋在土壤中，經(jīng)過30d左右，再從已腐爛的濾紙上篩選纖維素分解菌。想一想：將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋進(jìn)土壤多深？使纖維素分解菌聚在在濾紙上，一般濾紙埋在深約10cm左右的腐殖土壤中。異養(yǎng)需氧型的纖維素分解菌異養(yǎng)厭氧型的纖維素分解菌方法三：纖維素分解細(xì)菌亦可棲息于草食動(dòng)物的消化道、特別是反芻動(dòng)物的瘤胃中?？梢詮拇祟悇?dòng)物的消化道中取樣。2、選擇培養(yǎng)（1）選擇培養(yǎng)的目的：增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物。（2）制備選擇培養(yǎng)基a、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？b、這個(gè)培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進(jìn)行選擇的？

c、你能否設(shè)計(jì)一個(gè)對照實(shí)驗(yàn)，說明選擇培養(yǎng)基的作用。是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無瓊脂。

有選擇作用，本配方中的主要碳源是纖維素，所以能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基與之對照；或省略選擇培養(yǎng)這一步找出碳源、氮源提供氨基酸、維生素等生長因子（3）選擇培養(yǎng)的操作方法：

將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下振蕩培養(yǎng)1～2天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復(fù)選擇培養(yǎng)。a.為什么選擇培養(yǎng)的時(shí)候要置于搖床上振蕩培養(yǎng)？纖維素分解菌是異養(yǎng)需氧型細(xì)菌，通過振蕩培養(yǎng)，保持培養(yǎng)基中充足的氧氣；同時(shí)使纖維素分解菌與培養(yǎng)基混合均勻。b.為什么說可以“重復(fù)選擇培養(yǎng)”？進(jìn)一步增加纖維素分解菌的濃度。c.為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？在選擇培養(yǎng)條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)的則被抑制。3、梯度稀釋

按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋，請問稀釋范圍是多大？第一次實(shí)驗(yàn)稀釋范圍是103—1074、將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上1、制備培養(yǎng)基:參照旁欄中的比例2、涂布平板：將稀釋度為103～107的菌懸液各取0.1ml涂布在培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)碳源：CMC-Na（主）、酵母膏、土豆汁CMC-Na：羧甲基纖維素鈉提供氨基酸、維生素等生長因子提供能源5、挑選產(chǎn)生透明圈的菌落

參照課本剛果紅染色法（CR染色法），挑選產(chǎn)生透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。方法一：培養(yǎng)基長出菌落，覆蓋CR溶液，再加入NaCl溶液。方法二：制備滅菌好的CR溶液，在倒平板時(shí)與培養(yǎng)基混合后倒平板。想一想：這兩種方法各有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足？ABCDab方法一：培養(yǎng)基長出菌落，覆蓋CR溶液，再加入NaCl溶液。方法二：制備滅菌好的CR溶液，在倒平板時(shí)與培養(yǎng)基混合后倒平板。缺點(diǎn)：操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜；優(yōu)點(diǎn)：這樣顯示出的顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，不存在菌落混雜問題；缺點(diǎn)：產(chǎn)生淀粉酶的微生物、能降解剛果紅的微生物會產(chǎn)生“假陽性反應(yīng)”。四、結(jié)果分析與評價(jià)培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落：

設(shè)置對照，若對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中無菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。五、課題延伸

本課題對分解纖維素的微生物進(jìn)行了初步的篩選，但是這只是分離純化的第一步。為確定得到的是纖維素分解菌，還需要進(jìn)行測定纖維素酶（液體發(fā)酵和固體發(fā)酵）的實(shí)驗(yàn)，纖維素酶的測定方法一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄