傳統(tǒng)與改良影印培養(yǎng)法在生物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用綜述,分子生物學(xué)論文自1992年發(fā)明以來(lái)，作為一種重要的挑選方式方法被用在微生物及遺傳學(xué)中的各個(gè)領(lǐng)域，這種挑選方式方法對(duì)微生物突變菌株，基因突變體等的挑選起到了很重要的作用，然而傳統(tǒng)影印培養(yǎng)法在使用經(jīng)過(guò)中表現(xiàn)出使用的絲絨材料價(jià)格較貴、需反復(fù)滅菌和使用不便等缺點(diǎn)，為了使該方式方法操作簡(jiǎn)便快速可靠，不斷的出現(xiàn)改進(jìn)的影印培養(yǎng)法。本文從傳統(tǒng)影印培養(yǎng)法到改進(jìn)影印培養(yǎng)法在生物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用予以綜述。1傳統(tǒng)影印培養(yǎng)法1952年Lederberg發(fā)明了影印培養(yǎng)法，該方式方法是將原始菌落影印在一系列選擇性平板的一樣位置上，用這種方式方法能夠挑選得到一樣遺傳型的菌落，其經(jīng)過(guò)是：把長(zhǎng)有菌落的原始培養(yǎng)皿倒置于包有絨布〔已滅菌〕的木質(zhì)圓柱〔直徑略小于培養(yǎng)皿直徑〕上，使平板上的菌落影印在絨布上，然后把這一印章上的菌落逐一接種到不同的選擇性培養(yǎng)基平板上，待這些平板培養(yǎng)后，對(duì)各平板一樣位置上的菌落作比照，就可挑選出所需的突變型菌株。圖1就是利用影印培養(yǎng)法證明E.coliK12自發(fā)地產(chǎn)生抗鏈霉素突變株的實(shí)驗(yàn)示意圖。其方式方法是：首先把大量對(duì)鏈霉素敏感的E.coliK12細(xì)胞涂布在不含鏈霉素的平板上，待其長(zhǎng)出很多小菌落后，用影印法接種到不含鏈霉素的培養(yǎng)基平板上，然后再影印到含有鏈霉素的選擇性培養(yǎng)基平板上。影印的作用主要是保證三個(gè)平板上培養(yǎng)的菌落具有親緣性和菌落在平板上生長(zhǎng)的位置保持嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)性。經(jīng)培養(yǎng)后，在平板上有個(gè)別抗鏈霉素的菌落生長(zhǎng)，對(duì)培養(yǎng)皿和進(jìn)行比擬，就能在平板的相應(yīng)位置找出平板上生長(zhǎng)的那幾個(gè)抗性菌落的孿生兄弟。然后把平板中對(duì)應(yīng)位置上的菌落挑至不含鏈霉素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，然后再涂布在平板上，然后重復(fù)上述步驟。反復(fù)重復(fù)上述同一經(jīng)過(guò)后，就只要在培養(yǎng)皿和中涂上越來(lái)越少的原菌液后，便可在平板上長(zhǎng)出越來(lái)越多的抗性菌落，這樣便可得到完全純的抗性菌株群體。由此可知，在這個(gè)經(jīng)過(guò)中，原始的鏈霉素敏感菌株只通過(guò)移種和選擇序列，也就是講在根本未接觸過(guò)任何一點(diǎn)鏈霉素的情況下，便能夠挑選到抗鏈霉素的突變株。影印培養(yǎng)法實(shí)驗(yàn)最初的設(shè)計(jì)是為證明微生物的抗藥性突變是自發(fā)的，與相應(yīng)的環(huán)境因素?zé)o關(guān)，當(dāng)前已被廣泛的應(yīng)用在營(yíng)養(yǎng)缺陷型的挑選及抗藥性菌株的挑選等研究工作中。但是傳統(tǒng)影印培養(yǎng)法在實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)中有一定的缺陷，主要表如今下面四個(gè)方面：①不合適菌落密度大的平板。在影印經(jīng)過(guò)中，原始菌落轉(zhuǎn)移至絲絨上時(shí)需要摁壓，菌落被壓平，菌落面積擴(kuò)大，進(jìn)而在子板上構(gòu)成接近扁平樣的菌落。細(xì)菌密度高或者分布不均勻，就會(huì)造成菌落間的污染；②生長(zhǎng)節(jié)拍不同，體積大小不同的菌落，影印效果不同。會(huì)出現(xiàn)污染或者挑選不到所需要的菌落等缺點(diǎn)；③平板上的邊緣和影印效果不同。邊緣部分比部分容易受力，所以邊緣部分比部分易于影印，因而為了照顧平板菌落的影印效果，容易造成邊緣菌落受壓過(guò)大，菌落變形的情況，尤其在第二次影印時(shí)表現(xiàn)明顯；④影印要求高質(zhì)量的絲絨。價(jià)格比擬昂貴，其次每次需要將絨布固定于圓柱面上，所以操作步驟復(fù)雜也增加了污染的可能性。2改進(jìn)的平板影印工具徐民俊等在對(duì)生產(chǎn)用釀酒酵母進(jìn)行遺傳改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)傳統(tǒng)影印平板工具進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)后的影印平板工具是將長(zhǎng)度一樣的大量竹簽捆扎成與平皿內(nèi)蓋直徑相近的捆，整平接觸菌落的面，然后將反面用膠粘于平皿內(nèi)蓋，60℃烘干，滅菌待用〔圖2〕。影印時(shí)將該工具與細(xì)菌接觸的面朝上平放在超凈臺(tái)上，打開(kāi)上蓋即可,假如需要反復(fù)使用該工具，可在第一次影印后，將影印的一面在75%乙醇中浸泡2min，輕輕甩去太多的無(wú)水乙醇，在超凈臺(tái)上吹干5min即可重復(fù)使用?？梢砸灾苽涠嗵祝y(tǒng)一滅菌。徐民俊等使用改進(jìn)的影印平板工具進(jìn)行3輪影印傳代后，順利地挑選出大規(guī)模的轉(zhuǎn)化子。該改進(jìn)的平板影印工具與傳統(tǒng)平板影印方式方法有很大的區(qū)別，使影印操作更為簡(jiǎn)便，減少了污染的可能性,并且影印效果清楚明晰，能夠到達(dá)與母板一樣的生長(zhǎng)狀況。改進(jìn)的影印平板工具具有三方面的優(yōu)點(diǎn)：①材料經(jīng)濟(jì)，工藝簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，無(wú)需其他介質(zhì)，降低了污染；②邊緣菌落和菌落影印效果幾乎一樣，大菌落和小菌落影印效果也一樣；③影印效果良好。影印時(shí)不會(huì)將菌落壓平，無(wú)論影印幾版，皆不會(huì)使菌落擴(kuò)散，因而避免了菌落間的穿插污染。該工具也存在兩方面的缺點(diǎn)：①直徑大于2mm的菌落，將會(huì)導(dǎo)致一個(gè)母板菌落構(gòu)成2個(gè)子板菌落。②由于材料是用竹簽制作的，滅菌屢次之后竹簽會(huì)變的脆弱，所以使用時(shí)間不長(zhǎng)，假如要批量生產(chǎn)，材料換成鋼鐵類(lèi)則可長(zhǎng)期使用。3低熔點(diǎn)瓊脂糖影印培養(yǎng)法ShobhanaNatarajan等將傳統(tǒng)的影印培養(yǎng)法進(jìn)行改進(jìn)，用改進(jìn)的低熔點(diǎn)瓊脂糖影印培養(yǎng)法簡(jiǎn)單快速的轉(zhuǎn)移了哺乳動(dòng)物細(xì)胞，然后用接種環(huán)挑取陽(yáng)性克隆，挑選得到需要表型的細(xì)胞，這種轉(zhuǎn)移速度較快，大大地減少了培養(yǎng)和分離稀有表型所花費(fèi)的時(shí)間。詳細(xì)經(jīng)過(guò)如此圖3所示，細(xì)胞培養(yǎng)在直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，長(zhǎng)到肉眼可見(jiàn)1000個(gè)細(xì)胞時(shí)影印，每個(gè)平板的培養(yǎng)基是20ml3%的低熔點(diǎn)瓊脂糖冷卻到37℃后，和2.5ml10濃縮生長(zhǎng)培養(yǎng)基以及2.5ml的血清混合〔終濃度為1培養(yǎng)基和10%血清〕，培養(yǎng)后用PBS洗掉平板中的血清，并在室溫下向每個(gè)平板的細(xì)胞中添加1mL的Trypsin-EDTA，在顯微鏡下觀察平板，待每個(gè)克隆中均有一些細(xì)胞變圓時(shí)棄去胰蛋白酶，并用含有瓊脂糖的新鮮培養(yǎng)基〔包含添加血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基〕培養(yǎng)10~15分鐘，使其在平板中繼續(xù)生長(zhǎng)。一個(gè)無(wú)菌的V型小竹板插在瓊脂糖中作為參考標(biāo)記，這個(gè)參考標(biāo)記插入的位置在原始平板的底部，然后將這個(gè)平板反向影印在直徑為15cm的培養(yǎng)皿中，同時(shí)在第一個(gè)平板中參加生長(zhǎng)培養(yǎng)基讓每個(gè)克隆〔包含大多數(shù)的細(xì)胞〕剩余的細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，接著將第二個(gè)直徑為10cm的平板中的瓊脂糖倒入10cm的培養(yǎng)皿中，克隆也隨著轉(zhuǎn)移，插入的參考標(biāo)記隨后放在第二個(gè)平板中，用巴斯德吸管在瓊脂糖上戳眼來(lái)趕走培養(yǎng)基中的氣泡，為了使轉(zhuǎn)移的細(xì)胞粘附在培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在37℃下孵育16~24小時(shí)。此種改進(jìn)方式方法應(yīng)用在細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，比擬新穎，在這種方式方法中用低熔點(diǎn)瓊脂糖來(lái)作為影印工具，這種工具能夠隨培養(yǎng)基一起配置，減少了外面介質(zhì)，因而減少了污染的可能性。其次，在這里方式方法中能夠利用瓊脂糖的低熔點(diǎn)性來(lái)控制影印，在溫度高的時(shí)候瓊脂糖溶解在培養(yǎng)基中，起到培養(yǎng)細(xì)胞的作用，溫度低時(shí)瓊脂糖凝固，作為固體介質(zhì)進(jìn)行影印。再次細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞都貼壁，用胰蛋白酶消化能夠使細(xì)胞脫落，消化的程度能夠控制脫落的濃度，到合適濃度時(shí)進(jìn)行影印，最合適的細(xì)胞濃度為每個(gè)培養(yǎng)皿20~50個(gè)克隆時(shí)，能夠減少克隆之間的穿插感染。4結(jié)束語(yǔ)自從1952年Lederberg發(fā)明了影印培養(yǎng)法以來(lái)，已經(jīng)被廣泛的用在細(xì)菌和酵母遺傳學(xué)來(lái)挑選需要的表型，在細(xì)胞轉(zhuǎn)移和挑選方面用的較少，也能夠用抗體染色的方式方法來(lái)鑒定目的基因不同表示出程度的克隆，挑選抗菌素，挑選抗菌活性強(qiáng)的肽，從環(huán)境中分離有益的微生物，在限制性溫度下來(lái)鑒定易感的克隆，或者根據(jù)應(yīng)用和特殊表型的需要進(jìn)行其它挑選，因而在生物實(shí)驗(yàn)中具有重要的指導(dǎo)意義。本文從傳統(tǒng)的影印培養(yǎng)法技術(shù)到改進(jìn)的影印培養(yǎng)技術(shù)，從應(yīng)用此技術(shù)來(lái)挑選突變菌株到挑選需要表型的細(xì)胞進(jìn)行討論，傳統(tǒng)影印培養(yǎng)技術(shù)的影印工具是絨布，徐民俊等改進(jìn)的影印工具是扎成捆的牙簽，ShobhanaNatarajan等改進(jìn)的影印工具是低熔點(diǎn)的瓊脂糖，并用滅菌的小竹板插入培養(yǎng)基中做標(biāo)記，這幾種技術(shù)各有利弊，詳細(xì)能夠根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要來(lái)選用，可以以根據(jù)實(shí)驗(yàn)自行進(jìn)行改進(jìn)。根據(jù)前面所述，發(fā)如今影印培養(yǎng)技術(shù)中克隆之間的污染是一個(gè)很重要的問(wèn)題，解決此問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)操作中注意事項(xiàng)是一方面，主要的方面還有克隆密度的大小，假如克隆密度太大，可能不合適用這種技術(shù)來(lái)挑選，由于影印之后克隆之間不能很好地分開(kāi)，達(dá)不到挑選的作用，可以能會(huì)造成污染。影印培養(yǎng)中的參考標(biāo)記確實(shí)定也很重要，假如標(biāo)記不準(zhǔn)確則會(huì)被誤選。原始平板和影印平板的直徑大小有一定的要求，要事先設(shè)計(jì)好，原始平板的直徑要比影印平板的直徑小，假如原始平板的直徑大于等于影印平板的直徑則不能進(jìn)行影印。以下為參考文獻(xiàn)［1］LederbergJ，LederbergEM.Replicaplatingandindirectselectionofbacterialmutants［J].Bacteriol.1952，63:399~406.［2］徐禎，徐慶妍，胡志鈺，等.平板影印與AHBA合成酶基因挑選用于安莎類(lèi)抗生素產(chǎn)生菌的分離［J].廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)〔自然科學(xué)版〕，2020，51〔1〕：107－111.［3］GrunsteinM，HognessDS.Colonyhybridization：amethodfortheisolationofclonedDNAsthatcontainaspecificgene［J].ProcNatlAcadSciUSA，1975，72〔10〕:3961－3965.［4］EskoJD，RaetzCR.Replicaplatingandinsituenzymaticassayofanimalcellcoloniesestablishedonfilterpaper［J］.ProcNatlAcadSciUSA，1978，75〔3〕:1190－1193.［5］鄭幼霞，趙人俊，張益菜.慶豐鏈霉菌中SQPI質(zhì)?？刂浦掠缘倪z傳證明［J］.遺傳學(xué)報(bào)，1982，9〔1〕:8-13.［6］徐民俊，田小群，周世寧.一