小米黃色素的分離提取及抗氧化活性研究摘要：目的：確定小米粉中黃色素超聲輔助提取最佳工藝條件，并對其抗氧化活性進行評價。方法：在單因素試驗基礎上，以OD值為響應值，應用響應面Box-Behnken試驗設計對色素提取工藝條件進行優(yōu)化，同時探究小米黃色素的體外抗氧化能力。結果：超聲波輔助提取小米黃色素的最佳條件為：超聲功率200W、料液比為1∶15（g/mL）、過篩目數80目、超聲時間40min，預測最大吸光度為0.64，實際吸光度的平均值為0.62。小米黃色素對1,1-二苯基苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）自由基和羥自由基（·OH）清除作用明顯，且具有較好的還原能力。結論：利用響應面Box-Behnken試驗分析結果可靠，得到了小米黃色素超聲波輔助提取的最佳工藝條件，實驗結果表明小米黃色素具有抗氧化活性。關鍵詞：小米黃色素分離提取抗氧化ExtractionandinvitroAntioxidantActivityofYellowPigmentfromMilletQian-Xu1,2,Huimin-Liu2,3,Mingzhu-Zheng1,2,Meihong-Liu1,2,Jiahan-Xie1,2,Jingsheng-Liu1,2*1.CollegeofFoodScienceandEngineering，JilinAgriculturalUniversity(Changchun130118)；2.NationalEngineeringLaboratoryonWheatandCornFurtherProcessing(Changchun130118)；3.CollegeofLifeScience，JilinAgriculturalUniversity(Changchun130118)Abstract:Objective:Todeterminetheoptimalconditionsofultrasonicextractionofyellowpigmentinmilletflourandevaluateitsantioxidantactivity.Methods:Basedonthesinglefactortest,theresponsevalueofthepigmentextractionprocesswasoptimizedbyusingtheresponsesurfaceBox-Behnkentestdesign,andtheantioxidantcapacityofthemilletyellowpigmentwasalsoexplored.Results:Theoptimalconditionsforultrasonicextractionofbeigeyellowwereasfollows:ultrasonicpower200W,ratioofmaterialtoliquid1:15(g/mL),sievehead80mesh,ultrasonictime40min,predictedmaximumabsorbance0.64,Theactualabsorbanceisanaverageof0.62.Theremovalof1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy(DPPH)andhydroxylradical(·OH)wassignificantandhadgoodreducingability.Conclusion:TheresultsoftheBox-Behnkentestwerereliableandtheoptimalconditionswereobtainedbyultrasonicassistedextractionofmilletyellowpigment.Theexperimentalresultsshowedthattheyellowpigmenthadantioxidantactivity.Keywords:milletyellowpigmentseparationextractionantioxidant小米中的黃色素主要存在于種皮細胞，即小米的表層細胞中，是一類天然的食用黃色素[1-3]。天然色素具有食用安全、可靠、色澤自然等特點，并且還具有一定的營養(yǎng)保健功能[4-7]。因此，開發(fā)利用天然食用色素以取代合成色素已成為人們日益關注的課題[8,9]。近年來，國內外大量科研和臨床試驗證明，天然類胡蘿卜素不僅具有視覺保健及治療作用，而且可以提高人體免疫機能，清除體內多余的自由基[10]，可預防癌癥，并對潰瘍、皮膚病變等多種疾病具有很好的治療效果[11-15]。此外，小米黃色素在食品領域中也被廣泛應用，可用作各種食品、飲料及糖果等的著色劑，具有顏色鮮明、色澤圓潤自然同時兼具營養(yǎng)保健作用[16-26]。小米黃色素主要是類胡蘿卜素類物質，但是關于小米黃色素分離提取以及功能活性研究卻鮮有報道。本試驗通過Box-Behnken試驗設計和響應面分析法，對小米黃色素的提取條件進行了優(yōu)化，并且對其穩(wěn)定性及體外抗氧化活性進行試驗。本試驗結果可為小米黃色素在食品添加劑及保健食品領域的開發(fā)和應用提供參考。1.1材料與試劑小米（產地：內蒙古赤峰），無水乙醇、甲醇、三氯乙酸、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯化鐵、30%雙氧水均為國產分析純。水為超純水。葉黃素、玉米黃素、β-隱黃素（標準品，sigma公司）。1.2儀器與設備JY98-IIIDN型超聲波細胞粉碎機上海習仁科學儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀美國Agilent公司；MultiskanFC型酶標儀美國Thermro公司；Pico17型離心機ELEctronCorporation；RE-52A型旋轉蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；PHS-3C型pH計上海精密科學儀器有限公司；DZK2-D-1型電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫(yī)療儀器廠。1.3方法1.3.1小米黃色素粗提取流程小米→粉碎→過篩→超聲波輔助提取→離心分離→上清液→濃縮→色素粗提液1.3.2單因素試驗方法以OD445值為指標，分別考察超聲功率、液料比、過篩目數和提取時間對小米色素提取效果的影響。其中超聲功率分別為100、150、200、250、300W，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/ml），過篩目數分別為不過篩、40、60、80、100目，提取時間分別為20、30、40、50、60min。1.3.3響應面優(yōu)化試驗設計在單因素試驗基礎上，根據二次回歸組合試驗設計原理，以小米黃色素OD值為響應值，設計超聲功率、乙醇體積分數、提取時間、液料比四個因素進行響應面分析試驗，試驗設計見表1。表1因素水平編碼表Table1Factorsandlevelsusedforresponsesurfaceanalysis編碼值因素X1超聲功率（W）X2料液比（g/ml）X3過篩目數（目）X4提取時間（min）-12001:1060300250120100501.4小米黃色素化學成分鑒別將提取出的小米黃色素采用HPLC法分析其化學組成，色譜柱：C18；流動相：甲醇：水=86:14；經典柱壓：76bar；柱溫25℃；紫外可見檢測器波長445nm；進樣量20μl。1.5小米黃色素穩(wěn)定性分析1.5.1光照對小米黃色素穩(wěn)定性的影響將小米色素粗提液1ml定容到25ml，分別放置于避光、室內自然光和日光直射處1~7天后觀察色素的色澤變化，并且在445nm波長處測定色素的OD值。1.5.2溫度對小米黃色素穩(wěn)定性的影響將小米色素粗提液1ml定容到25ml，分別放置于不同溫度（4、20、40、60、80、100℃）條件下，觀察色素在12小時內的色澤變化，并在445nm波長處測定其OD值。1.5.3pH值對小米黃色素穩(wěn)定性的影響將小米色素粗提液用不同pH溶液定容到25ml，搖勻放在室溫條件下，60min后觀察色素的色澤變化，并在445nm波長處測定OD值。1.6體外抗氧化性測定1.6.1DPPH自由基清除能力測定取不同質量濃度的小米色素溶液與提前配制的DPPH溶液（0.0026gDPPH，甲醇定容至50mL，避光放置）1:1混合，同時設置空白組及對照組，混勻后置于暗室中靜置30min，于517nm波長處測定OD值，按式（1）計算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率/%=（1-EQ\F(Ax,A0)）×100（1）式中：Ax為樣品溶液的吸光度；A0為對照溶液的吸光度。1.6.2·OH清除率測定將配置好的9mmol/LFeSO4溶液、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液、不同各質量濃度的小米色素溶液1.0ml等量混勻。再加入8.8mmol/LH2O2溶液1.0mL啟動反應，振搖混勻后將試管迅速移入37℃水浴鍋中，靜置30min后于510nm波長處測定不同質量濃度樣品液的OD值Ax。用蒸餾水代替H2O2時在510nm波長處測得對應質量濃度的本底吸光度。用蒸餾水代替樣品在510nm波長處測得對照吸光度，按式（2）計算樣品對·OH的清除率。·OH清除率=（1-EQ\F(Ax-Ax0,A0)）×100（2）式中：Ax為樣品溶液的吸光度；Ax0為用蒸餾水代替H2O2時測得對應濃度的本底吸光度，A0為蒸餾水代替樣品測得對照吸光度。1.6.3還原力測定取不同質量濃度的小米色素溶液1.0mL于試管中，再依次加入0.2mol/LpH6.6的磷酸緩沖液和質量分數1%鐵氰化鉀溶液各2.0mL，混合均勻后，立即放入50℃水浴反應20min取出冷卻至室溫，加入2.0mL質量分數10%三氯乙酸終止反應。離心后吸取反應液2.0mL，再加入2.0mL蒸餾水和0.4mL質量分數0.1%FeCl3溶液，振搖混勻，暗室反應30min后于700nm波長處測定吸光度。1.7數據分析采用prismgraphpad對單因素試驗中的各因素進行比較分析。采用OriginPro8.5數據處理專家進行響應面試驗設計和分析。同時所有實驗均重復3次。2結果與分析2.1單因素試驗2.1.1超聲功率對色素提取效果的影響圖1超聲功率對總色素提取率的影響Fig.1Effectofultrasonicpowerontheextractionyieldofpigment在料液比1:15（g/ml）、過8篩目數為80、提取時間為40min的條件下，研究不同超聲功率對色素提取效果（OD值）的影響。從圖1可以看出，隨著超聲功率的增大，吸光值升高，功率為250W到300W后，吸光值開始呈下降趨勢，這可能是因為隨著功率的增強,對小米細胞內部結構產生了較強的破壞作用，進而微小的淀粉粒逐漸析出，吸附了部分色素分子，從而導致提取液中小米黃色素含量下降。因此,超聲波輔助提取小米黃色素時，超聲波功率以250W為宜。2.1.2料液比對色素提取效果的影響圖2料液比對色素提取率的影響Fig.2Effectofmaterial/liquidratioontheextractionyieldofpigment在超聲功率200W、過篩目數為80（目）、提取時間為40min的條件下，研究不同料液比對色素提取效果（OD值）的影響。由圖2可看出,在料液比為1:5~1:15時，隨液料比的增加小米黃色素吸光值迅速增加；當液料比大于1:15時，吸光值增幅減小并逐漸趨于穩(wěn)定，且差異不顯著(P<0.05)，從節(jié)約提取溶劑方面考慮，宜選用1:15作為提取液料比。2.1.3過篩目數對色素提取效果的影響圖3過篩目數對色素提取效果的影響Fig.3Effectofmeshnumberontheextractionyieldofpigment在超聲功率200W、料液比1:15（g/ml）、提取時間為40min的條件下，研究不同過篩目數對色素提取效果（OD值）的影響。由圖3可看出，隨著目數的增加，OD值也隨之增大，可見粉碎目數跟色素提取效果正相關。但是80目以后，提取效果趨勢趨緩，所以過篩目數選擇80目為宜。2.1.2提取時間對色素提取效果的影響圖4提取時間對總色素提取率的影響Fig.4Effectofextractiontimeontheextractionyieldofpigment由圖4可看出，在提取時間為20~50min時，隨提取時間的延長，小米黃色素含量呈上升逐漸趨勢；當提取時間為50min時，提取液中的黃色素含量達到最大；提取時間為50~60min時，小米黃色素含量無明顯變化。其原因可能是隨著超聲波對溶劑體系作用時間的增加，持續(xù)的機械振動與空化作用導致小米組織結構破壞，體系中淀粉顆粒溶出量增加，部分色素分子被吸附；同時，由于持續(xù)的超聲波作用使部分黃色素的分子結構受到破壞，也可能是溶液中黃色素含量下降的原因之一，這與超聲波功率對提取液中黃色素含量的影響類似。2.2響應面分析法對色素提取工藝的優(yōu)化2.2.1Box-Behnken試驗設計與結果Box-Behnken實驗方案相關數據如表2所示。將實驗數據Design-Expert8.0.6軟件進行多元回歸擬合，得到紫薯皮粉色素溶液的吸光值對超聲功率（A）、料液比(B)、過篩目數(C)和時間(D)的二次多項回歸方程：吸光度(A值)=0.64+(5.833E-004)A+0.021B+(5.583E-003)C-0.023D-0.019AB+0.017AC+0.023AD+0.060BC+0.068BD-0.013CD-0.10A2-0.079B2-0.095C2表2響應面分析設計及結果Table2Experimentaldesignandresultsofresponsesurfaceanalysis試驗號A-功率B-料液比C-過篩目數D-時間吸光度123456789101112131415161718192021222324252627282901-1000000-100101-1101-1-1100-10000-10-1-1110-1-10000010-1100000010100-1000-1001000-10-10-100-1011000011101010-100-1-101-1-100010100000001-10.5240.4210.420.3910.390.5160.630.3660.580.5030.630.4460.440.4370.4350.440.4030.60.480.390.4370.5450.620.620.5270.6890.4730.460.503將上述回歸模型進行方差分析，如表3所示，該回歸模型為極顯著(P＜0.01)。回歸模型失擬項P＞0.05，不顯著，說明該回歸模型擬合度好，可以將此模型用于小米黃色素超聲波輔助提取工藝結果的分析和預測。從表中可知，交互項BC、BD影響顯著，二次項的影響都為極顯著。表3回歸方程方差分析表Table3Analysisofvarianceforthe?ttedregressionequation方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性模型ABCDAB

ACADBCBDCDA2B2C2D2誤差項失擬項純誤差所有項0.184.083E-0065.504E-0033.741E-0046.120E-0031.406E-0031.156E-0032.209E-0030.0150.0196.760E-0040.0680.0410.0580.0330.0370.0343.377E-0030.22141111111111111114104280.0134.083E-0065.504E-0033.741E-0046.120E-0031.406E-0031.156E-0032.209E-0030.0150.0196.760E-0040.0680.0410.0580.0332.670E-0033.400E-0038.442E-0044.841.530E-0032.060.142.290.530.430.835.446.980.2525.4815.3221.8812.474.030.00280.96940.17300.71380.15220.47990.52120.37840.03510.01930.62260.00020.00160.00040.00330.0958************注:*差異顯著，P＜0.05；**差異極顯著，P＜0.012.2.2各因素交互作用響應面圖從圖5中可看出A、B、C、D四個因素對吸光值（A值）的影響，圖中的曲線越陡峭，該因素對吸光值的影響越大，等高線圖反映了存在極值的條件在圓心處。A、B、C、D四個影響因素，每2個因素之間的交互作用對響應值的影響程度，其中因素B（料液比）C（過篩目數）之間、B（料液比）D（時間）之間的交互作用比較顯著。分析得出提取色素的最佳條件為超聲功率200W、料液比為1∶15（g/mL）、過篩目數80目、超聲時間40min，預測最大吸光度為0.64，實際吸光度的平均值為0.62。圖5各因素交互作用響應面圖Fig.5Responsesurfaceplotsshowingtheeffectofinteractionsamongfourfactorsontheabsorbanceofpigment2.3液相色譜分析321321圖6小米黃色素的HPLC分析Fig.6HPLCprofilesofmilletyellowpigment將提取出的小米黃色素進行液相分析，結果如圖所示，其主要組成分別為1號峰葉黃素和2號峰玉米黃素，以及3號峰β-隱黃素。2.4穩(wěn)定性分析結果2.4.1光照對色素穩(wěn)定性的影響圖7光照對色素穩(wěn)定性（吸光度）的影響Fig.7In?uenceoflightonstabilityofpigment從圖中可以看出，在避光處放置一周的小米黃色素，其保存率（保存率=（測定OD值/初始OD值）×100%）基本不變；置于室內自然光照條件下的小米色素的保存率呈直線下降趨勢；而日光照射6天小米色素的保存率不足50%。結果表明：光照對小米黃色素的穩(wěn)定性影響較大，日光對其有明顯的破壞作用，而放置在避光處則影響很小，這與其他類胡蘿卜素的光穩(wěn)定性研究結果一致[7]。所以，小米黃色素在儲存過程中應避免日光照射，宜避光保存。2.4.2溫度對色素穩(wěn)定性的影響圖8溫度對色素穩(wěn)定性的影響Fig.8Effectoftemperatureonthestabilityofthepigment室溫下放置6h小米色素保存率未發(fā)生明顯變化；40e下小米色素保存率96.63%；60e下小米色素保存率93.83%；80e加熱1h，小米色素保存率96.49%，加熱6h后小米色素保存率94.67%；100e加熱1h，小米色素的色素保存率95.23%，加熱6h后小米色素92.14%。隨著溫度的升高和加熱時間的延長，兩者的降解速度都有所加快，而其酯對熱較穩(wěn)定相一致。因而應避免在80e以上高溫下長時間加熱。2.4.3pH值對色素穩(wěn)定性的影響圖9pH值對色素穩(wěn)定性的影響Fig.9EffectofpHonthestabilityofthepigment在強酸性范圍(pH值1~4)內,小米色素吸光值下降較大。放置4dpH值2的小米色素保存率48.42%,葉黃素47.99%;pH值3的小米色素保存率80.70%,葉黃素71.56%。在堿性范圍內二者的吸光值都略有增加,而小米色素在pH值11、12時出現下降,這可能由于實驗誤差造成的。上述結果說明,強酸性范圍對小米色素和葉黃素的穩(wěn)定性影響較大,在堿性范圍內小米色素吸光值略有增加,這與大多數關于類胡蘿卜素pH值穩(wěn)定性的研究結果相一致[6]。2.5小米黃色素體外抗氧化測定結果2.5.1小米黃色素對DPPH自由基清除作用圖10不同質量濃度色素對DPPH自由基的清除作用Fig.10ScavengingactivityofsorghumpigmentatvariousconcentrationsagainstDPPH?freeradicals在10μg/ml~60μg/ml的濃度范圍內，小米黃色素對DPPH自由基的清除能力隨溶液濃度的增大而增加，呈明顯的量效關系。小米黃色素表現出較強的抗氧化能力，表明小米黃色素是一種優(yōu)良的自由基清除劑。2.5.2小米黃色素對·OH的清除作用圖11不同質量濃度色素對·OH的清除作用Fig.11Scavengingactivityofsorghumpigmentatvariousconcentrationsagainsthydroxylfreeradicals小米色素在0.1~2.0mg/ml范圍內，隨質量濃度的增加，對OH·的清除能力增加。清除率為50%的濃度(EC50)為1.2mg/mL，說明小米黃色素具有較好的清除·OH能力。EC5o值越小，表明其對OH·清除能力越強。反之，則越弱。2.5.3小米黃色素的還原能力圖12不同質量濃度色素的還原能力Fig.12Reducingpowerofsorghumpigmentatvariousconcentrations抗氧化劑的還原能力與其抗氧化性之間存在聯系?？寡趸瘎┦峭ㄟ^自身的還原作用給出電子而清除自由基的，其還原能力越強，抗氧化性越強。因此，可以通過測定還原能力來說明抗氧化活性的大小。試驗中發(fā)現小米黃色素的還原能力在10~100μg/ml范圍內，隨著濃度的增加，還原能力呈線性增加，說明它有一定的還原能力及較強的抗氧化性。3結論超聲波輔助提取小米黃色素操作簡便、能耗低、提取效率高，以響應面方法分析得出提取色素的最佳條件，最佳條件為超聲功率200W、料液比為1∶15（g/mL）、過篩目數80目、超聲時間40min，預測最大吸光度為0.64，實際吸光度的平均值為0.62。穩(wěn)定性研究結果表明，小米黃色素在日光直射的條件下光穩(wěn)定性較差，避光條件下呈現非常穩(wěn)定的狀態(tài)，因此貯存和運輸過程中應盡量避免長時間暴露在光照中；小米黃色素比較耐熱，但60℃以后小米黃色素吸光度緩慢降低，因此，長時間保存和使用過程中盡量避免高溫；堿性條件下，穩(wěn)定性較強，不能保存在破壞其穩(wěn)定性的極強酸環(huán)境中。本實驗通過色素溶液對·OH和DPPH自由基的清除以及對總還原力的測定，與VC作對照說米黃色素具有有較好的抗氧化能力，且在一定的質量濃度范圍內呈現一定線性關系，但是其抗氧化性低于VC。小米黃色素的提取和體外抗氧化的研究為小米換色素的進一步開發(fā)研究提供了初步的理論依據，小米黃色素的體內試驗還有待于進一步研究，為開發(fā)以小米黃色素為主的功能性食品奠定基礎。參考文獻[1]薛月圓，李鵬，林勤保.小米的化學成分及物理性質的研究進展［J］.中國糧油學報，2008，23（3）：199-202.[2]王海濱，夏建新.小米的營養(yǎng)成分及產品研究開發(fā)進展［J］.糧食科技與經濟，2010，35（4）：36-38.[3]張超，張暉，李冀新.小米的營養(yǎng)以及應用研究進展［J］.中國糧油學報，2007，22（1）：51-55.[4]楊健，孫大慶.發(fā)酵型小米營養(yǎng)乳加工技術的研究［J］.黑龍江八一農墾大學學報，2013，25（2）：42-47.[5]韓雅珊.類胡蘿卜素的功能研究進展［J］.中國農業(yè)大學學報，1999（1）：5-9.[6]PSHegde，TSChandra

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