NGS實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及質(zhì)量控制

上海市臨床檢驗(yàn)中心肖艷群

NGS特點(diǎn)應(yīng)用范圍廣：腫瘤、遺傳病、產(chǎn)前篩查、藥物基因組學(xué)、微生物等涉及的臨床科室多選擇平臺(tái)多流程復(fù)雜：濕實(shí)驗(yàn)分析過(guò)程：包括樣品處理、文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

干實(shí)驗(yàn)分析流程：包括序列比對(duì)、注釋及變異識(shí)別商品化試劑少：大多數(shù)為L(zhǎng)DT

如何做好質(zhì)量控制，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠？？？國(guó)家相關(guān)技術(shù)指南測(cè)序技術(shù)的個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)應(yīng)用指南（試行）遺傳性相關(guān)個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)應(yīng)用指南（試行）腫瘤個(gè)體化治療檢測(cè)應(yīng)用指南（試行）孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范

基本內(nèi)容實(shí)驗(yàn)室設(shè)置、設(shè)施和環(huán)境質(zhì)量管理體系人員設(shè)備與材料實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)分析前質(zhì)量控制分析過(guò)程質(zhì)量控制分析后質(zhì)量控制

一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置、設(shè)施與環(huán)境要求NGS實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)：經(jīng)批準(zhǔn)的個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室和臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室NGS實(shí)驗(yàn)室設(shè)置：嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》進(jìn)行設(shè)置。如果NGS項(xiàng)目的結(jié)果需經(jīng)Sanger測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證，還需為Sanger測(cè)序流程額外設(shè)置實(shí)驗(yàn)區(qū)域

實(shí)驗(yàn)室設(shè)置要求普通PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)置原則上分為四個(gè)區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)如使用全自動(dòng)擴(kuò)增分析儀，后兩區(qū)可合并如使用核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析一體化的全自動(dòng)分析系統(tǒng)，后三區(qū)可合并具體實(shí)驗(yàn)室分區(qū)應(yīng)根據(jù)其所使用的技術(shù)平臺(tái)及檢驗(yàn)項(xiàng)目和工作量而定NGS實(shí)驗(yàn)室設(shè)置原則：工作有序、互不干擾、防止污染、報(bào)告及時(shí)

普通PCR實(shí)驗(yàn)室

產(chǎn)物分析區(qū)擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)

緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)工作流向注意事項(xiàng)：各區(qū)有獨(dú)立的緩沖區(qū)各區(qū)都有水池各區(qū)有獨(dú)立的通風(fēng)系統(tǒng)標(biāo)本制備區(qū)有沖眼器和生物安全柜

產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷（全基因組低拷貝測(cè)序技術(shù)）

測(cè)序區(qū)文庫(kù)擴(kuò)增標(biāo)本與文試劑準(zhǔn)備區(qū)

與檢測(cè)區(qū)庫(kù)制備區(qū)

緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)

工作流向

標(biāo)本與文庫(kù)制備區(qū)：血漿分離、DNA提取、末段修復(fù)與純化、加“A”與純化、接頭連接與純化文庫(kù)擴(kuò)增與檢測(cè)區(qū)：PCR擴(kuò)增與純化、文庫(kù)濃度檢測(cè)、pooling、pooling后文庫(kù)定量測(cè)序區(qū)：測(cè)序前準(zhǔn)備（乳液PCR及磁珠富集）、測(cè)序上機(jī)、信息分析、報(bào)告審核及發(fā)放植入前胚胎遺傳學(xué)診斷（全基因組低拷貝測(cè)序）

電泳區(qū)測(cè)序區(qū)文庫(kù)檢測(cè)區(qū)擴(kuò)增一區(qū)WGA制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)

緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)

工作流向WGA制備區(qū)：全基因組擴(kuò)增電泳區(qū)：DNA檢測(cè)及結(jié)果反饋、DNA打斷擴(kuò)增一區(qū)：末端修復(fù)及純化、加“A”與純化、接頭連接與純化、pooling、缺口平移文庫(kù)檢測(cè)：測(cè)序區(qū)：擴(kuò)增前準(zhǔn)備（乳液PCR及磁珠富集）、測(cè)序儀上機(jī)數(shù)據(jù)分析、報(bào)告發(fā)放遺傳病診斷+腫瘤診斷與治療

（雜交捕獲測(cè)序技術(shù)+Sanger測(cè)序驗(yàn)證）

電泳區(qū)測(cè)序區(qū)文庫(kù)檢測(cè)區(qū)文庫(kù)擴(kuò)增區(qū)雜交鋪獲區(qū)DNA打斷區(qū)標(biāo)本與文試劑準(zhǔn)備

（擴(kuò)增二區(qū)（擴(kuò)增一區(qū)）庫(kù)制備區(qū)區(qū)

緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)標(biāo)本與文庫(kù)制備區(qū)：DNA提取及檢測(cè)、純化測(cè)OD、末端修復(fù)與純化、加“A”與純化、Adapter連接與純化雜交捕獲區(qū)：Pre-Captured-PCR與純化

、OD值檢測(cè)及pooling、雜交、洗脫與純化文庫(kù)擴(kuò)增與檢測(cè)區(qū)：Post-Captured-PCR與純化、Pooling及文庫(kù)定量檢測(cè)測(cè)序區(qū)：測(cè)序前準(zhǔn)備（C-Bot制備)、測(cè)序儀上機(jī)數(shù)據(jù)分析、結(jié)果解讀、Sanger驗(yàn)證、報(bào)告發(fā)放Sanger測(cè)序驗(yàn)證標(biāo)本與文庫(kù)制備區(qū)：DNA提取與檢測(cè)、目的片段PCR反應(yīng)準(zhǔn)備擴(kuò)增一區(qū)：目的片段擴(kuò)增與純化、測(cè)序PCR前準(zhǔn)備電泳區(qū)：電泳擴(kuò)增二區(qū)：測(cè)序PCR擴(kuò)增與純化測(cè)序儀上機(jī)、結(jié)果分析與解讀、報(bào)告發(fā)放高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)室設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)電泳區(qū)：DNA提取、DNA純化后大小檢定等步驟需用電泳，單獨(dú)成區(qū)，但不同的檢測(cè)項(xiàng)目可共用測(cè)序區(qū)：應(yīng)為恒溫恒濕實(shí)驗(yàn)室，2小時(shí)內(nèi)溫度波動(dòng)不超過(guò)2℃分區(qū)設(shè)置可根據(jù)自動(dòng)化儀器設(shè)備做適當(dāng)區(qū)間整合無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查實(shí)驗(yàn)室，因血漿提取為胎兒微量DNA，為防止污染，不能與其他項(xiàng)目的標(biāo)本制備區(qū)共用其他：實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)、生物安全柜等要求參照普通PCR實(shí)驗(yàn)室

實(shí)驗(yàn)室設(shè)置、設(shè)施與環(huán)境各工作區(qū)域應(yīng)有明確的標(biāo)記進(jìn)入和使用實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域應(yīng)有明確的限制和措施，防止非相關(guān)人員隨意進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)所用儀器和檢測(cè)過(guò)程對(duì)環(huán)境溫、濕度的要求，規(guī)定實(shí)驗(yàn)室溫、濕度允許范圍，并定期監(jiān)測(cè)和記錄不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染

實(shí)驗(yàn)室工作要求不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用標(biāo)本處理需在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，對(duì)具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須在生物安全柜內(nèi)開(kāi)蓋工作結(jié)束后，必須立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行消毒?？墒褂每梢苿?dòng)紫外燈在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺(tái)上60～90cm內(nèi)照射質(zhì)量管理體系建立作用建立并保持質(zhì)量管理體系有效運(yùn)行的重要基礎(chǔ)規(guī)范各項(xiàng)工作，保證工作質(zhì)量?jī)?nèi)容：質(zhì)量手冊(cè)、程序文件、操作規(guī)程、記錄依據(jù)：應(yīng)基于相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量手冊(cè)程序文件操作規(guī)程記錄

實(shí)驗(yàn)室管理文件內(nèi)容1.樣本的采集、運(yùn)送、保存、接收、登記和處理2、知情同意告知3、檢測(cè)方法和步驟4、試劑和耗材的選擇和保存（如為自配試劑，需詳細(xì)寫明試劑的制備過(guò)程及各原料的來(lái)源）5、試劑性能驗(yàn)證或自配試劑的性能評(píng)價(jià)和方法確認(rèn)6、儀器的使用、維護(hù)和校準(zhǔn)7、人員培訓(xùn)8、結(jié)果報(bào)告與解釋9、實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)、相關(guān)文件記錄與保存10、室內(nèi)質(zhì)量控制11、室間質(zhì)量評(píng)價(jià)或?qū)嶒?yàn)室間比對(duì)12、知情同意和保密程序文件編寫Why：目的Where：范圍Who：職責(zé)What：做什么When：何時(shí)做How：如何做注意：適合自身實(shí)際情況，可操作性

現(xiàn)行有效寫你所做的、做你所寫的、記你所做的

NGS項(xiàng)目SOP編寫要求實(shí)驗(yàn)室必須為每一個(gè)NGS檢測(cè)項(xiàng)目建立齊全和規(guī)范的SOPSOP源于一些標(biāo)準(zhǔn)文件和實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)工作經(jīng)驗(yàn)的積累SOP應(yīng)包括試劑準(zhǔn)備（試劑來(lái)源及配制）、樣品采集、樣品接收與預(yù)處理、核酸提取、測(cè)序方法和參數(shù)、測(cè)序儀器操作、生物信息學(xué)算法/軟件包和流程、結(jié)果分析和報(bào)告、實(shí)驗(yàn)室安全措施等

NGS項(xiàng)目SOP編寫要求對(duì)于檢測(cè)項(xiàng)目分析靶區(qū)域的描述（例如，多基因組合、外顯子組、全基因組、染色體非整倍性等）描述檢測(cè)項(xiàng)目可以適用的樣品類型（例如外周血、血漿、FFPE石蠟標(biāo)本），并指明本項(xiàng)目建立和驗(yàn)證過(guò)程中所采用的樣品類型用于核酸提取和文庫(kù)構(gòu)建的方法和試劑用于靶區(qū)域（例如多基因組合、外顯子組）捕獲的方法和試劑用于濕實(shí)驗(yàn)分析過(guò)程的對(duì)照與設(shè)置方法所用的測(cè)序平臺(tái)、測(cè)序反應(yīng)的試劑或耗材的版本（例如反應(yīng)池/flowcells、芯片）

測(cè)序設(shè)備上用于產(chǎn)生原始數(shù)據(jù)及輸出格式（如fastq文件）的軟件和版本號(hào)用于監(jiān)控和評(píng)估測(cè)序過(guò)程的指標(biāo)和質(zhì)量控制參數(shù)分析流程的接受和拒絕標(biāo)準(zhǔn)（例如，如果測(cè)序覆蓋度不能達(dá)到特定檢測(cè)項(xiàng)目的最低要求，采用NGS進(jìn)行靶向區(qū)域測(cè)序的結(jié)果就可能存在假陽(yáng)性或假陰性，從而與后續(xù)的Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果不符，因此就需要對(duì)于這類項(xiàng)目建立可以接受的靶向區(qū)域覆蓋度標(biāo)準(zhǔn)

）NGS生物信息分析SOP編寫要求詳細(xì)描述NGS數(shù)據(jù)的整個(gè)生物信息分析流程輸入文件、輸出文件及每步分析內(nèi)容每部過(guò)程中的質(zhì)控條件及參數(shù)(read的質(zhì)控、堿基質(zhì)量、測(cè)序深度、覆蓋度)數(shù)據(jù)篩選的流程及依據(jù)實(shí)驗(yàn)記錄實(shí)驗(yàn)條件、步驟、計(jì)算軟件試劑、引物、測(cè)序反應(yīng)、平臺(tái)檢測(cè)的目標(biāo)區(qū)域的描述（基因組、外顯子、特定基因、特定panel、甲基化等）分析中用的細(xì)節(jié)（文獻(xiàn)、網(wǎng)站）

記錄保存與管理根據(jù)相關(guān)要求，明確各種不同測(cè)序數(shù)據(jù)的保存類型和時(shí)間一般檢驗(yàn)報(bào)告單至少保存兩年檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)至少保存兩年室內(nèi)質(zhì)控和參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)記錄和質(zhì)控信息至少保存兩年儀器狀態(tài)和維修記錄要保留到儀器使用終身測(cè)序原始圖像數(shù)據(jù)可以不用長(zhǎng)期保存，其他后續(xù)數(shù)據(jù)（例如BAM、FASTQ、VCF文件）需要保存一段時(shí)間以供后期驗(yàn)證時(shí)調(diào)用建議測(cè)序原始或早期的數(shù)據(jù)保存時(shí)間不少于2年對(duì)于包含序列變異信息的VCF文件和包含醫(yī)學(xué)解釋的正式報(bào)告，建議長(zhǎng)期保存測(cè)序數(shù)據(jù)可以本地或云計(jì)算中心方式保存，應(yīng)保證個(gè)人信息私密性和安全性

三、人員要求NGS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室管理和技術(shù)人員：專業(yè)、學(xué)術(shù)水平、教育培訓(xùn)情況需符合要求NGS實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員：需有PCR上崗證，且應(yīng)接受NGS技術(shù)的理論與實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)，經(jīng)考核合格后方可上崗NGS數(shù)據(jù)分析人員：應(yīng)參與NGS數(shù)據(jù)分析培訓(xùn)，并考核合格后方可上崗；或已在NGS技術(shù)服務(wù)行業(yè)從事數(shù)據(jù)分析3年以上（有詳細(xì)記錄或證明資料）加強(qiáng)人員培訓(xùn)：制定適宜培訓(xùn)考核計(jì)劃，每次培訓(xùn)有詳細(xì)記錄

四、設(shè)備與材料實(shí)驗(yàn)室必須有合適、充分、質(zhì)量可靠的儀器、設(shè)備、試劑、耗材、輔助品，適用于各類型、各種工作量的需求，以保證檢驗(yàn)質(zhì)量選擇測(cè)序平臺(tái)需考慮的因素測(cè)序通量樣品通量讀段長(zhǎng)度（讀長(zhǎng)）覆蓋深度成本運(yùn)行時(shí)間測(cè)序首次成功率目前主流測(cè)序平臺(tái)主要性能與技術(shù)參數(shù)比較平臺(tái)名稱第1代

Sanger3500/3730第2代Roche454FLX系統(tǒng)

第2代

Roche454GSJunior第2代

HiSeq2500第2代

MiSeq第2代

IonProton第2代

IonPGM第2代

PSTAR-IIA公司

Thermo/ABIRoche/454Roche/455IlluminaIlluminaThermo/ABIThermo/ABI華因康基因

測(cè)序原理

Sanger/毛細(xì)管電泳測(cè)序

焦磷酸測(cè)序

焦磷酸測(cè)序

可逆鏈終止物和合成測(cè)序

可逆鏈終止物和合成測(cè)序

合成測(cè)序

合成測(cè)序

連接測(cè)序

檢測(cè)方法

熒光/光學(xué)

光學(xué)

光學(xué)

熒光/光學(xué)

熒光/光學(xué)

檢測(cè)pH值

檢測(cè)pH值

熒光/光學(xué)

準(zhǔn)確性

99.9%99%99%98%98%98%98%99%讀段長(zhǎng)度

600-1000bp230-500bp500bpRapid2x150bpHigh2x125bp2x150-2x300bp150-200bp35-400bp20-50bp單次檢測(cè)通量

100-600Kb200Mb50MbRapid10-180GbHigh50Gb-1Tb300Mb-15Gb10-100Gb3Mb-2Gb1-2Gb單次運(yùn)行時(shí)間

20min-3h24h24hRapid7-40hHigh<1d-6d5-55h2-4h2-8h8h優(yōu)點(diǎn)

讀段長(zhǎng)，準(zhǔn)確性高，易識(shí)別堿基重復(fù)區(qū)和多聚序列

讀段長(zhǎng)；比第一代的測(cè)序通量大

測(cè)序通量低，易于臨床靈活設(shè)計(jì)檢測(cè)項(xiàng)目

測(cè)序通量高，平均試劑成本低

測(cè)序通量低，易于臨床靈活設(shè)計(jì)檢測(cè)項(xiàng)目

無(wú)光學(xué)系統(tǒng)；成本低。1d內(nèi)可完成人全基因組測(cè)序全流程。

無(wú)光學(xué)系統(tǒng)；成本低。可在1d內(nèi)完成；通量低，適于臨床檢測(cè)

測(cè)序通量低，易于臨床靈活設(shè)計(jì)檢測(cè)項(xiàng)目

局限性

通量低；價(jià)格高

堿基重復(fù)區(qū)識(shí)別困難；操作復(fù)雜；儀器昂貴

堿基重復(fù)區(qū)識(shí)別困難；操作復(fù)雜；儀器昂貴

讀段短；儀器昂貴，測(cè)序及數(shù)據(jù)分析時(shí)間長(zhǎng)

讀段短；儀器、試劑昂貴，測(cè)序及數(shù)據(jù)分析時(shí)間長(zhǎng)

讀段較短；堿基重復(fù)區(qū)識(shí)別困難

讀段較短；堿基重復(fù)區(qū)識(shí)別困難

讀段短，數(shù)據(jù)分析時(shí)間長(zhǎng)

試劑要求實(shí)驗(yàn)室所使用的儀器、商品試劑、耗材、輔助品符合國(guó)家相關(guān)規(guī)定儀器：三證齊全試劑：CFDA批準(zhǔn)（高通量測(cè)序試點(diǎn)單位可在限定范圍內(nèi)開(kāi)展LDT）

儀器使用要求設(shè)備標(biāo)識(shí)：唯一性標(biāo)識(shí)、狀態(tài)標(biāo)識(shí)（正常使用、故障待修、停用報(bào)廢）、校準(zhǔn)標(biāo)識(shí)（下次校準(zhǔn)日期）設(shè)備檔案：設(shè)備標(biāo)識(shí)；制造商名稱、型號(hào)、序列號(hào)；制造商聯(lián)系人和電話；到貨日期和投入運(yùn)行日期；接收時(shí)狀態(tài)；說(shuō)明書(shū)；證實(shí)可以使用的性能記錄；已執(zhí)行及計(jì)劃進(jìn)行的維護(hù)；設(shè)備的損壞、故障、改動(dòng)或維修設(shè)備檢定/校準(zhǔn)：校準(zhǔn)參數(shù)、校準(zhǔn)量程、校準(zhǔn)結(jié)果評(píng)估設(shè)備使用：使用SOP、使用授權(quán)、有效性確認(rèn)、人員防護(hù)、使用記錄設(shè)備維護(hù)和保養(yǎng)：維修報(bào)告、故障修復(fù)后性能評(píng)估驗(yàn)證、維護(hù)周期及記錄設(shè)備報(bào)廢：去污染處理、保密信息去除

儀器校準(zhǔn)要求校準(zhǔn)程序中應(yīng)有需校準(zhǔn)的儀器、校準(zhǔn)單位、校準(zhǔn)周期、校準(zhǔn)參數(shù)、校準(zhǔn)符合要求的判斷標(biāo)準(zhǔn)需對(duì)加樣系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)，有合格的校準(zhǔn)報(bào)告（保留校準(zhǔn)原始記錄）校準(zhǔn)的頻度應(yīng)參照國(guó)家計(jì)量部門或制造廠商的要求進(jìn)行關(guān)注：校準(zhǔn)參數(shù)是否齊全、校準(zhǔn)量程是否覆蓋常用檢測(cè)量程、校準(zhǔn)結(jié)果是否符合檢測(cè)要求

五、實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)建立信息系統(tǒng)管理制度保證信息安全和完整（使用權(quán)限、維護(hù)規(guī)定、計(jì)算機(jī)安全保密和病毒防范要求，定期備份）使用計(jì)算機(jī)或自動(dòng)化設(shè)備收集、處理、記錄、報(bào)告、存儲(chǔ)或檢索數(shù)據(jù)時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確保做到針對(duì)每臺(tái)儀器設(shè)備使用的計(jì)算機(jī)軟件，制定詳細(xì)的使用說(shuō)明和操作流程，并驗(yàn)證其適用性制定并執(zhí)行相應(yīng)程序，保護(hù)計(jì)算機(jī)程序和代碼，以保護(hù)資料的完整性，防止無(wú)意的或未經(jīng)授權(quán)者訪問(wèn)、修改或破壞數(shù)據(jù)應(yīng)維護(hù)計(jì)算機(jī)和自動(dòng)化設(shè)備，確保其正常運(yùn)轉(zhuǎn)，并應(yīng)提供相應(yīng)的環(huán)境和操作條件

六、分析前質(zhì)量控制ISO/IEC15189對(duì)于分析前程序的明確定義：按照時(shí)間順序，從臨床醫(yī)生開(kāi)出醫(yī)囑開(kāi)始，到分析檢驗(yàn)程序時(shí)終止的步驟，包括檢驗(yàn)申請(qǐng)、患者的準(zhǔn)備、原始樣品的采集、運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室并在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行傳輸分析前質(zhì)量管理是最易出現(xiàn)問(wèn)題、涉及人員最多、潛在因素最多、最難控制的環(huán)節(jié)

分析前主要環(huán)節(jié)確保患者樣品的采集方法正確在采集過(guò)程中確保樣品和信息的完整和準(zhǔn)確性

在檢測(cè)前和檢測(cè)后的樣品的運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程符合規(guī)范患者樣品處理（例如核酸提?。┓弦?guī)范

信息采集常規(guī)信息：包括樣品唯一性編號(hào)或條碼、采樣日期、采樣時(shí)間、受檢者姓名、性別、出生日期、樣品來(lái)源（所采樣品的組織類型）、采樣單位、采樣人姓名可根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目制定臨床信息采集表，內(nèi)容包括：檢測(cè)項(xiàng)目、樣品唯一性編號(hào)或條碼、受檢者姓名、出生日期、年齡、民族、采樣日期、樣品類型、相關(guān)的臨床資料（如身高、體重、疾病診斷、疾病分型分期、合并疾病、用藥情況）和臨檢信息、采樣單位及科室名稱、醫(yī)生姓名、送檢目的等臨檢實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有專業(yè)人員根據(jù)信息采集表對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目的合理性進(jìn)行審核，必要時(shí)可與送檢醫(yī)生討論

患者的正確識(shí)別及知情同意正確識(shí)別：樣品容器上應(yīng)注明患者的唯一信息，通常應(yīng)包括檢測(cè)條碼或編號(hào)、待檢者的姓名、送檢科室和住院號(hào)等信息患者知情同意：涉及遺傳基因信息的臨床檢測(cè)項(xiàng)目，所有受檢者均需簽署知情同意書(shū)，告知所檢測(cè)項(xiàng)目的目的、意義、基本過(guò)程、剩余核酸的去向及保存時(shí)間、臨檢樣品是否可匿名用于科研項(xiàng)目等，確保受檢者的個(gè)人隱私（包括醫(yī)療記錄和醫(yī)療數(shù)據(jù)）得到保護(hù)對(duì)實(shí)施有創(chuàng)檢查的分子診斷項(xiàng)目如穿刺取活檢組織，采集人員應(yīng)首先對(duì)檢查可能遇到的風(fēng)險(xiǎn)清楚地告知患者及家屬，并對(duì)緊急情況下的緊急預(yù)案如實(shí)告知，使患者及家屬全面了解某些特殊檢查可能帶來(lái)的后果

知情同意書(shū)是醫(yī)方履行如實(shí)告知義務(wù)的證據(jù)，也是患者行使選擇權(quán)的書(shū)面依據(jù)

樣品的采集、運(yùn)送和保存用于測(cè)序樣品種類包括：全血樣本、血漿樣本、組織標(biāo)本（新鮮組織、冰凍組織、石蠟包埋組織、穿刺標(biāo)本）、口腔拭子和骨髓等采樣臨床醫(yī)生需進(jìn)行樣品采集要求培訓(xùn)，確保樣品采集質(zhì)量，避免污染和干擾實(shí)驗(yàn)室應(yīng)向樣品采集和運(yùn)輸人員提出樣品收集、處理、運(yùn)送和保存要求

核酸提取方法及質(zhì)控提取方法酚-氯仿提取法：可能導(dǎo)致DNA樣品中酚或氯仿殘留，抑制PCR反應(yīng)鹽析法：可能存在蛋白質(zhì)及其他物質(zhì)的殘余，DNA的純度和得率不高DNA提取要求在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行操作DNA質(zhì)控：要求OD值介于1.6-1.8之間，濃度大于50ng/μL血漿游離DNA提取：需盡可能消除血漿中各種可能抑制DNA聚合反應(yīng)的抑制成分，包括血漿蛋白、血紅蛋白、細(xì)胞碎片等，建議采用基于微柱吸附技術(shù)的商業(yè)化提取試劑盒。根據(jù)所需檢測(cè)的項(xiàng)目不同，提取的游離DNA總量應(yīng)為50ng-1000ng

樣品保存DNA保存：純化DNA在TEbuffer中常溫下可放置26周；2-8℃冰箱中可放置至少1年；長(zhǎng)期保存應(yīng)在0℃以下如果DNA在提取后幾天內(nèi)用于PCR或酶切，也可用雙蒸水進(jìn)行溶解。建議將DNA原液保存于-70℃或以下當(dāng)同一個(gè)受檢者的DNA樣品要進(jìn)行多個(gè)檢測(cè)時(shí)，建議將DNA樣品分裝后保存，即減少反復(fù)凍融引起的DNA降解，又可減少樣品間的污染對(duì)于純化后的血漿游離DNA，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目對(duì)于DNA量的需求及時(shí)分裝，暫時(shí)不用于檢測(cè)的DNA標(biāo)本應(yīng)及時(shí)凍存于-80℃以下，避免反復(fù)凍融而加劇游離DNA的碎片化程度、降低后續(xù)檢測(cè)的靈敏度

檢測(cè)后樣品的保存和處理樣品在檢測(cè)后要進(jìn)行一定時(shí)間保留，以備必要時(shí)復(fù)查完成檢測(cè)后剩余的DNA樣品至少在-80℃保存2年。DNA在-70℃的環(huán)境下可保存至少7年。純度不高的DNA樣品建議保存在-20℃或更低的溫度中，以確保DNA的完整性廢棄的樣品應(yīng)作為生物危險(xiǎn)品處置

七、分析過(guò)程質(zhì)量控制檢驗(yàn)項(xiàng)目開(kāi)展檢驗(yàn)方法的確認(rèn)與驗(yàn)證質(zhì)量控制程序建立

檢驗(yàn)項(xiàng)目開(kāi)展有明確臨床需求：臨床是否有需求、實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否影響病人診療臨床價(jià)值：篩選、診斷、預(yù)后判斷、預(yù)測(cè)、監(jiān)測(cè)、確診等檢驗(yàn)周期（TAT）

方法學(xué)確認(rèn)CAP和ISO15189不同認(rèn)可體系對(duì)方法學(xué)確認(rèn)的要求共同點(diǎn)：新的檢測(cè)方法應(yīng)用到病人臨床診斷前必須進(jìn)行方法學(xué)確

認(rèn)，以了解該檢測(cè)方法的臨床表現(xiàn)，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度CAP提出了具體的要求：

實(shí)驗(yàn)室必須進(jìn)行分析確認(rèn)各項(xiàng)檢測(cè)的性能參數(shù)，確認(rèn)的參數(shù)包括：精密度、準(zhǔn)確度、報(bào)告范圍、參考區(qū)間、分析靈敏度、分析特異性等；還應(yīng)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)覆蓋的標(biāo)本范圍（如不同的基因型等）、標(biāo)本類型（如血液、尿液、新鮮/冷凍組織、石蠟包埋組織等）

方法性能確認(rèn)（與驗(yàn)證區(qū)別）確認(rèn)（validation)驗(yàn)證(varification)定義通過(guò)提供客觀證據(jù)證明預(yù)期的使用或應(yīng)用要求已得到滿足通過(guò)提供客觀證據(jù)證明特定的要求已得到滿足對(duì)象實(shí)驗(yàn)室自建檢測(cè)方法（LDTs）CFDA批準(zhǔn)試劑、檢測(cè)系統(tǒng)（IVDs）時(shí)間1、正式開(kāi)展項(xiàng)目之前應(yīng)完成確認(rèn)2、儀器或關(guān)鍵試劑更換、檢測(cè)樣品類型變

化、實(shí)驗(yàn)室必須重新進(jìn)行性能確認(rèn)1、新開(kāi)項(xiàng)目前應(yīng)完成驗(yàn)證2、對(duì)原有項(xiàng)目的儀器、試劑、方法更

新時(shí)應(yīng)驗(yàn)證參數(shù)準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍，參考區(qū)間，分析靈敏度（檢測(cè)下限）、分析特異性（抗干擾物質(zhì)），其他涉及的重要指標(biāo)（標(biāo)本穩(wěn)定性、試劑穩(wěn)定性等）

準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍、參考區(qū)間判斷標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室自行建立標(biāo)準(zhǔn)（可參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或文獻(xiàn)）試劑盒或檢測(cè)系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)提供的參數(shù)（廠商聲明）如何進(jìn)行方法學(xué)確認(rèn)(以腫瘤NGS檢測(cè)為例)腫瘤NGS性能確認(rèn)參數(shù)有哪些？參數(shù)如何評(píng)價(jià)？如何對(duì)每個(gè)檢測(cè)基因進(jìn)行性能評(píng)價(jià)?性能確認(rèn)最低應(yīng)當(dāng)使用多少標(biāo)本？

確認(rèn)參數(shù)?如何確認(rèn)？平臺(tái)確認(rèn)確定平臺(tái)鑒定一大范圍基因組區(qū)域一些遺傳變異的能力檢測(cè)方法確認(rèn)生物信息分析確認(rèn)明確要求提供準(zhǔn)確的序列數(shù)據(jù)和在靶向基因組區(qū)域內(nèi)的變異

生物信息學(xué)分析獨(dú)立于檢測(cè)系統(tǒng)，先于檢測(cè)方法確認(rèn)，單獨(dú)進(jìn)行理想化生物信息分析確認(rèn)利用一些包含已知變異的序列樣本來(lái)驗(yàn)證整個(gè)數(shù)據(jù)分析流程的精確性、特異性、重復(fù)性確認(rèn)的樣本數(shù)量依據(jù)不同平臺(tái)決定確認(rèn)樣本的選擇可考慮一些權(quán)威的樣本數(shù)據(jù)，如HapMap樣本、已知遺傳變異的細(xì)胞系、之前分析過(guò)的臨床樣本

檢測(cè)方法確認(rèn)精密度：每種類型的變異最少需要3個(gè)參考樣品（突變百分比接近檢測(cè)下限），

可同一批重復(fù)檢測(cè)3次（批內(nèi)），不同批間重復(fù)檢測(cè)3次，在不同天，

有2名不同操作人員進(jìn)行（批間）準(zhǔn)確度：推薦使用Sanger測(cè)序法作為比較方法，突變百分比低的樣本可采用其

它方法驗(yàn)證檢測(cè)下限：可被重復(fù)檢測(cè)出突變等位基因百分比的最低濃度可采用已知突變等位基因百分比的樣本與另一基因組DNA混合稀釋進(jìn)行評(píng)價(jià)分析特異性：干擾物質(zhì)報(bào)告范圍：可測(cè)定的基因區(qū)域研究檢測(cè)方法確認(rèn)如何對(duì)每個(gè)檢測(cè)基因進(jìn)行性能評(píng)價(jià)可從不同的突變類型（單核苷酸變異、缺失、拷貝數(shù)變異和結(jié)構(gòu)變異）和臨床意義明確的常見(jiàn)基因如臨床實(shí)驗(yàn)室可接受多種樣本類型，對(duì)每種樣本類型均需分別進(jìn)行評(píng)價(jià)最低標(biāo)本數(shù)：NGS檢測(cè)項(xiàng)目、檢測(cè)基因以及檢測(cè)突變類型等均有不同，難以統(tǒng)一規(guī)定性能確認(rèn)時(shí)的最低樣本數(shù)。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際情況（檢測(cè)基因數(shù)量、檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜程度等）自行確定當(dāng)某個(gè)新試驗(yàn)通過(guò)確認(rèn)，開(kāi)始在臨床使用——這不是確認(rèn)的終點(diǎn)隨著數(shù)據(jù)的積累及陽(yáng)性樣本數(shù)量的增加，可用來(lái)進(jìn)行方法學(xué)的持續(xù)評(píng)估

方法學(xué)確認(rèn)的持續(xù)性

質(zhì)控要求編寫室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)的操作規(guī)程，以監(jiān)控和評(píng)價(jià)分析過(guò)程的質(zhì)量凡出具臨床檢測(cè)報(bào)告的項(xiàng)目均應(yīng)開(kāi)展室內(nèi)質(zhì)控凡出具臨床檢測(cè)報(bào)告的項(xiàng)目均應(yīng)參加室間質(zhì)評(píng)或室間比對(duì)

室內(nèi)質(zhì)控目的監(jiān)測(cè)和控制實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作的精密度，即實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的批內(nèi)和批間重復(fù)性IQC結(jié)果決定了實(shí)驗(yàn)室即時(shí)測(cè)定結(jié)果的可靠性和有效性

室內(nèi)質(zhì)控質(zhì)控品數(shù)量：已知陰性和弱陽(yáng)性質(zhì)控品腫瘤NGS陰性質(zhì)控品：不是指突變陰性的樣本，建議采用無(wú)模板對(duì)照為陰性質(zhì)控品，包含所有擴(kuò)增步驟，證實(shí)樣本和試劑無(wú)核酸污染陽(yáng)性質(zhì)控品：包括至少一個(gè)已知突變位點(diǎn)，最好變異百分比接近檢測(cè)下限，已證實(shí)低百分比的突變可在每批次中檢出質(zhì)控樣本無(wú)需在每批檢測(cè)中包括所有突變類型，只需加入一個(gè)已知突變位點(diǎn)的質(zhì)控品。但實(shí)驗(yàn)室最好有多個(gè)突變的質(zhì)控品，并在日常檢測(cè)中輪流使用質(zhì)控樣本可以采用人基因組DNA或其它合成的帶有突變的基因組DNA樣品檢測(cè)時(shí)，需要記錄和評(píng)價(jià)NGS性能檢測(cè)的特征性QC參數(shù)，包括：覆蓋深度、序列覆蓋一致性、用于評(píng)價(jià)堿基識(shí)別和比對(duì)的質(zhì)量值、等位基因百分率、鏈偏倚、GC偏倚以及信號(hào)密度衰減等，并且與檢測(cè)驗(yàn)證過(guò)程中的參數(shù)進(jìn)行比較對(duì)于影響臨床決策的核酸變異結(jié)果，在簽發(fā)報(bào)告之前，需要另外采用備選方法（如Sanger測(cè)序、SNP芯片等）對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行確證

室間質(zhì)評(píng)凡出具臨床檢測(cè)報(bào)告的項(xiàng)目均應(yīng)參加室間質(zhì)評(píng)（已有腫瘤、產(chǎn)篩）室間質(zhì)評(píng)樣本應(yīng)與臨床標(biāo)本同等對(duì)待及時(shí)分析室間質(zhì)評(píng)反饋結(jié)果，對(duì)不合格項(xiàng)目，應(yīng)查找原因（人員操作誤差、儀器狀態(tài)、試劑、調(diào)查品質(zhì)量等、檢測(cè)系統(tǒng)）采取糾正措施

監(jiān)測(cè)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性

無(wú)室間質(zhì)評(píng)項(xiàng)目的替代方法應(yīng)定期（每年至少一次）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)：比對(duì)樣品數(shù)量至少5份，濃度包括正常和異常水平當(dāng)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)不可行或不適用時(shí)，實(shí)驗(yàn)室可以采用其他替代方法，如樣本的盲法重檢、與其他方法比較或者臨床相關(guān)性的分析判斷檢測(cè)結(jié)果的可接受性對(duì)結(jié)果不一致的標(biāo)本，應(yīng)采取措施進(jìn)行結(jié)果確認(rèn)

八、檢驗(yàn)后質(zhì)量控制檢驗(yàn)后過(guò)程包括系統(tǒng)性評(píng)審，規(guī)范格式和解釋，授權(quán)發(fā)布、報(bào)告和傳送結(jié)果檢驗(yàn)結(jié)果的臨床解讀

檢測(cè)報(bào)告檢測(cè)報(bào)告基本要求：包含個(gè)人基本信息、檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)方法、檢測(cè)方法局限性、本次檢測(cè)關(guān)鍵參數(shù)（NGS的測(cè)序覆蓋深度等），結(jié)果解釋所參考的文獻(xiàn)資料等信息基因的核酸信息：基因的核酸信息包括染色體基因組DNA序列和mRNA序列，核酸信息參考NCBIGenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)參考序列?；蚪MDNA序列GenBank注冊(cè)號(hào)前面用NT、NC或AC加下劃線進(jìn)