分子生物學(xué)—原核表達調(diào)控3第1頁/共53頁6.1σ因子的調(diào)節(jié)作用不同的σ因子可以獨立地起作用，但是，為了保證細胞準(zhǔn)確地響應(yīng)不同的環(huán)境信號變化，σ因子之間常常交互作用構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模式，使得原核基因的表達穩(wěn)定而平衡。σ因子本身的活性受蛋白水解酶的調(diào)控，也能被同源的抗σ因子失活?？功乙蜃幽軌蚺c特定的σ因子結(jié)合，阻止它們與RNA聚合酶組裝。第2頁/共53頁1.原核生物RNA聚合酶α2ββ’ωσ

第3頁/共53頁σ亞基（σfactor）的功能是幫助核心酶識別啟動子，它不是RNA鏈延伸必需的。

σ能提高RNA聚合酶與特異啟動子的親和力，也能降低與非特異啟動子的親和力。新生RNA鏈達到6-9個核苷酸，形成穩(wěn)定的酶-DNA-RNA復(fù)合物時，σ因子釋放。

Theσfactor通過降低核心酶與非特異序列的親和力,和增加其與啟動子的親和力來幫助核心酶識別啟動子。無σfactor的核心酶也能在DNA模板上合成RNA，但不能正確地起始轉(zhuǎn)錄。

第4頁/共53頁E.coli有不同的σfactor分別轉(zhuǎn)錄不同類型的基因。這在基因表達調(diào)控中起重要作用。第5頁/共53頁連續(xù)置換6.1.1噬菌體SPO1基因的表達第6頁/共53頁6.1.2枯草桿菌的孢子形成過程中的級聯(lián)調(diào)控芽孢的形成與釋放第7頁/共53頁第8頁/共53頁芽孢形成過程中的σ因子激活級聯(lián)σF激活早期芽孢形成基因的轉(zhuǎn)錄σE激活母細胞前期分化基因的轉(zhuǎn)錄隔膜第9頁/共53頁σG激活晚期芽孢形成基因的轉(zhuǎn)錄σK激活母細胞后期分化基因的轉(zhuǎn)錄σ級聯(lián)保證了芽孢形成過程中各個步驟按正確的順序發(fā)生。在σ級聯(lián)中每一σ因子控制著芽孢形成的一個階段，并且控制著在下一階段發(fā)揮作用的σ因子合成。并且在母細胞和芽孢之間存在著信息交換，使前芽孢和母細胞中的基因表達相互協(xié)調(diào)。第10頁/共53頁抗σ因子與抗抗σ因子第11頁/共53頁6.1.3熱激蛋白的表達大腸桿菌的最適生長溫度是37℃。當(dāng)溫度上升至46℃時，大腸桿菌幾乎停止生長。在46℃下細胞合成的蛋白質(zhì)大約30％為一組相當(dāng)保守的熱激蛋白（heatshockprotein,HSP）。很多熱激蛋白是分子伴侶（molecularchaperones）和蛋白酶。分子伴侶的作用是介導(dǎo)蛋白質(zhì)正確折疊；蛋白酶的作用則是降解受到熱損傷而又不能修復(fù)的蛋白質(zhì)。第12頁/共53頁熱激蛋白的表達調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。熱激蛋白基因的啟動子被σ32而不是通常的σ70識別。σ32也不能識別σ70啟動子，因為這兩種σ因子識別的啟動子序列不一樣第13頁/共53頁HSP的誘導(dǎo)合成是由于細胞內(nèi)的σ32水平瞬間升高引起的。在熱激條件下，σ32的合成會增加，熱激誘導(dǎo)σ32合成發(fā)生在翻譯水平。

另一方面，在熱激條件下σ32的穩(wěn)定性也增加了。第14頁/共53頁第15頁/共53頁6.2組蛋白類似蛋白的調(diào)節(jié)作用細菌中存在一些組蛋白類似蛋白，能非特異地結(jié)合DNA，維持其高級結(jié)構(gòu)（例如H-NS）。H-NS與大腸桿菌基因組上分散的大量基因的調(diào)控區(qū)有較高的親和性，這些基因大都與環(huán)境條件的變化有關(guān)，H-NS的結(jié)合能抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄。第16頁/共53頁6.3轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用大腸桿菌中大約有300多個基因編碼與啟動子區(qū)結(jié)合的蛋白，它們能激活或抑制轉(zhuǎn)錄，稱為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。它們大多是序列特異性的DNA結(jié)合蛋白，能與特定的啟動子結(jié)合。有些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能調(diào)控很多基因的表達（如CRP,FNR,IHF,Fis…），有些只能調(diào)節(jié)一兩個啟動子。許多基因的啟動子區(qū)有多個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合位點，共同作用才能使RNA聚合酶順利起始基因轉(zhuǎn)錄。第17頁/共53頁6.4抗終止作用抗終止蛋白阻止轉(zhuǎn)錄的終止作用，因此RNA聚合酶能夠越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄DNA?？菇K止因子在RNAP到達終止子之前與之結(jié)合。主要見于噬菌體和少數(shù)細菌。第18頁/共53頁噬菌體是以E.coli為宿主的溫和病毒。它一旦感染細菌就會以2種方式繁殖。①溶源途徑：噬菌體感染E.coli后，將其基因組整合到細菌染色體上，隨著細菌染色體的復(fù)制而復(fù)制。整合有噬菌體基因組的細菌稱為溶源菌，這一過程稱為溶源途徑。②溶菌途徑：噬菌體感染宿主后也可以利用細菌細胞內(nèi)的養(yǎng)料進行繁殖，最終使宿主裂解而死亡，這一過程稱為溶菌途徑。溶菌途徑需要噬菌體DNA的復(fù)制和病毒外殼蛋白的形成。λ噬菌體裂解周期中的級聯(lián)調(diào)控依賴于抗終止作用

第19頁/共53頁λ噬菌體裂解周期中的級聯(lián)調(diào)控依賴于抗終止作用

第20頁/共53頁溶源性細菌在正常情況下非常穩(wěn)定；但在細菌受某些外界物理或化學(xué)因素(如紫外線、絲裂霉素C等)的作用，就會有效的轉(zhuǎn)向溶菌途徑。原噬菌體便脫離細菌染色體而進行自主復(fù)制，于是細菌裂解，游離出大量的噬菌體，這一過程稱為溶源性誘導(dǎo)。對繁殖途徑的選擇依賴于細胞對2種選擇性基因表達程序的選擇。第21頁/共53頁第22頁/共53頁BacteriophageLambda

極早期：早期：晚期：第23頁/共53頁第24頁/共53頁第25頁/共53頁第26頁/共53頁第27頁/共53頁第28頁/共53頁7.轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是生物最經(jīng)濟的調(diào)控方式。但轉(zhuǎn)錄生成mRNA以后，再在翻譯或翻譯后水平進行“微調(diào)”，是對轉(zhuǎn)錄調(diào)控的補充，它使基因表達的調(diào)控更加適應(yīng)生物本身的需求和外界條件的變化。調(diào)控方式有：mRNA自身結(jié)構(gòu)元件對翻譯起始的調(diào)控mRNA穩(wěn)定性對轉(zhuǎn)錄水平的影響調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控作用反義RNA的調(diào)節(jié)作用稀有密碼子對翻譯的影響重疊基因?qū)Ψg的影響翻譯的阻遏魔斑核苷酸水平對翻譯的影響第29頁/共53頁7.1mRNA自身結(jié)構(gòu)元件對翻譯起始的調(diào)控大腸桿菌有14%的基因起始密碼子是GUG、3%為UUG，另有兩個是AUU，這些密碼子與fMet-tRNA的配對能力弱，從而導(dǎo)致翻譯效率下降。RBS的結(jié)合強度取決于SD序列的結(jié)構(gòu)及與AUG的距離。SD與AUG相距一般以4～10核苷酸為佳，9核苷酸最佳。mRNA的二級結(jié)構(gòu)也是翻譯起始調(diào)控的重要因素。因為核糖體的30S亞基必須與mRNA結(jié)合，要求mRNA5’端有一定的空間結(jié)構(gòu)。SD序列的微小變化，往往會導(dǎo)致表達效率成百上千倍的差異，這是由于核苷酸的變化改變了形成mRNA5’端二級結(jié)構(gòu)的自由能，影響了30S亞基與mRNA的結(jié)合，從而造成了蛋白質(zhì)合成效率上的差異。第30頁/共53頁7.2mRNA穩(wěn)定性對轉(zhuǎn)錄水平的影響所有細胞都有一系列核酸酶，用來清除無用的mRNA。一個典型的mRNA半衰期為2-3min。mRNA分子被降解的可能性取決于其二級結(jié)構(gòu)。第31頁/共53頁7.3調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控作用細菌中有些mRNA結(jié)合蛋白可激活靶基因的翻譯。相反，mRNA特異性抑制蛋白則通過與核糖體競爭性結(jié)合mRNA分子來抑制翻譯的起始。大腸桿菌中的核糖體蛋白就存在翻譯抑制現(xiàn)象。第32頁/共53頁阻抑蛋白靶基因作用位點R17外殼蛋白R17復(fù)制酶核糖體結(jié)合位點的發(fā)夾結(jié)合T4RegAT4早期mRNA含有起始密碼子的各種序列T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶S-D序列T4p32基因32單鏈5'前導(dǎo)序列與mRNA起始區(qū)結(jié)合抑制翻譯的阻抑蛋白第33頁/共53頁7.4反義RNA的調(diào)節(jié)作用RNA調(diào)節(jié)是原核基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的另一種重要機制。細菌響應(yīng)環(huán)境壓力的改變，會產(chǎn)生一些非編碼小RNA分子，能與mRNA中的特定序列配對并改變其構(gòu)象，導(dǎo)致翻譯過程的開啟或關(guān)閉等作用。1983年Mizuno、Simous、Kleckner同時發(fā)現(xiàn)反義RNA（antisenseRNA）。反義RNA(antisenseRNA)是與mRNA互補的RNA分子。第34頁/共53頁7.4.1反義RNA的作用反義RNA能與mRNA分子特異性地互補結(jié)合，從而抑制該mRNA的加工與翻譯?？烧{(diào)控原核細胞中基因表達、控制噬菌體溶菌-溶源狀態(tài)以及抑制轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)位作用等。在真核細胞中也存在反義RNA，但功能尚未全部搞清楚。通過人工合成反義RNA的基因，并將其導(dǎo)入細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出反義RNA，即能抑制特定基因的表達，阻斷該基因的功能，有助于了解該基因?qū)毎L和分化的作用。同時也有對腫瘤實施基因治療的可能性。第35頁/共53頁7.4.2反義RNA的作用機制①反義RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和（或）編碼區(qū)，引起翻譯的直接抑制或與靶mRNA結(jié)合后引起該雙鏈RNA分子對RNaseⅢ的敏感性增加，使其降解。②反義RNA與mRNA的SD序列的上游非編碼區(qū)結(jié)合，從而抑制靶mRNA的翻譯功能。其作用機制可能是反義RNA與靶mRNA的上游序列結(jié)合后阻止了核糖體的結(jié)合。③反義RNA可直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。反義RNA和mRNA有不完全的互補序列，可以形成雙鏈的RNA雜交體。而在mRNA上緊隨雜交區(qū)之后的是一段U豐富區(qū)。其結(jié)構(gòu)類似于終止子結(jié)構(gòu)，從而使轉(zhuǎn)錄開始不久后即終止。第36頁/共53頁第37頁/共53頁第38頁/共53頁第39頁/共53頁7.4.3人工合成構(gòu)建反義RNA通過人工設(shè)計在天然狀態(tài)下不存在的反義RNA，可調(diào)節(jié)靶基因的表達。由于對靶mRNA的SD序列上游區(qū)的結(jié)構(gòu)了解甚少，因此，很難設(shè)計用于和靶mRNASD序列上游區(qū)結(jié)合的反義RNA。在原核生物中針對SD序列及其附近區(qū)域的反義RNA的作用可能更有效。在真核生物中，對應(yīng)于5‘端非編碼區(qū)的反義RNA比針對編碼區(qū)的反義RNA更有效。也有實驗表明針對第一內(nèi)含子的反義RNA也同樣有效。如果在靶mRNA上找到一段連續(xù)的U序列，就可以設(shè)計出反義RNA，與該U序列上游的mRNA鏈互補，以形成類似終止子結(jié)構(gòu)。在轉(zhuǎn)錄水平上抑制靶基因的表達。第40頁/共53頁第41頁/共53頁RegulationoftargetRNAsbyOxySandDsrA.TheleftboxshowsaschematicsofinhibitionmechanismsofOxySandtherightboxinhibitionbyDsrA.第42頁/共53頁7.6稀有密碼子對翻譯的影響dnaG、rpoD及rpsU屬于大腸桿菌基因組上的同一個操縱子，而這3個基因產(chǎn)物在數(shù)量上卻大不相同，每個細胞內(nèi)50個拷貝的dnaG蛋白，2800個拷貝的rpoD蛋白；40000個拷貝的rpsU蛋白?；蜣D(zhuǎn)錄出來的三個蛋白相應(yīng)的mRNA拷貝數(shù)大體相同，由于翻譯的調(diào)控使得蛋白的拷貝數(shù)發(fā)生了很大的變化。細胞可通過翻譯調(diào)控不同蛋白含量的高低。即使對于同一操縱子上不同的基因，其產(chǎn)物在數(shù)量上也可大不相同。第43頁/共53頁

許多調(diào)控蛋白在細胞內(nèi)含量很低，編碼這些蛋白的基因中高頻率地使用了很多稀有密碼子，稀有密碼子對應(yīng)次要（低豐度）的tRNA。因此，翻譯速度受tRNA供應(yīng)的限制，影響了蛋白質(zhì)合成的總量。而其它基因中利用這些稀有密碼子頻率很低。第44頁/共53頁第45頁/共53頁7.7重疊基因?qū)Ψg的影響正常情況下，trp操縱子中5個基因產(chǎn)物是等量的，但trpE突變后，其鄰近的trpD產(chǎn)量比下游trpBA產(chǎn)量要低得多。研究trpE和trpD以及trpB和trpA兩對基因中核苷酸序列與翻譯的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)trpE基因的終止密碼子和trpD基因的起始密碼子共用核苷酸。

trpE---ThrPheSTP...ACUUUCUGAUGGCU...MetAla---trpDtrpB---GluIleSTP...GAAAUCUGAUGGAA...MetGlu---trpA偶聯(lián)翻譯是保證兩個基因產(chǎn)物在數(shù)量上相等的重要手段。第46頁/共53頁glaT的終止密碼子與K的起始密碼子相隔3個核苷酸，但K基因的SD序列卻位于T基因的終止密碼子之前。當(dāng)T翻譯終止時，核糖體覆蓋了SD序列和K基因的起始密碼子，還沒有脫落就開始了K的翻譯。第47頁/共53頁7.8翻譯的阻遏轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控一般都是蛋白質(zhì)或某些小分子物質(zhì)對基因轉(zhuǎn)錄的阻遏或激活，而在翻譯水平上也發(fā)現(xiàn)了類似的蛋白質(zhì)阻遏作用。大腸桿菌RNA噬菌體Qβ包含有3個基因，當(dāng)噬菌體感染細菌，RNA進入細胞后，這條稱為(+)鏈的RNA可直接作為模板指導(dǎo)RNA復(fù)制酶的翻譯，并與宿主中已有的亞基結(jié)合行使復(fù)制功能。但是Qβ(+)RNA鏈上已結(jié)合有許多核糖體，它們從5′向3′方向進行翻譯，這必將會影響復(fù)制酶催化的從3′→5′端方向進行的(-)RNA鏈的合成。這一矛盾的解決就需要QβR