分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)第1頁/共91頁分子生物學(xué)研究分子生物學(xué)研究對(duì)象分子生物學(xué)研究技術(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：核酸的分離純化、鑒定與分析基因工程技術(shù)基本流程第2頁/共91頁Contents核酸的分離制備及分析1基因工程基本流程2分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用儀器介紹3第3頁/共91頁2011級(jí)碩士生分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)核酸的分離制備及分析及在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

DNA的制備與分析真核細(xì)胞基因組DNA的分離純化(蛋白酶K法)DNA的紫外定性、定量分析及瓊脂糖凝膠電泳鑒定

基因表達(dá)水平分析的原理與方法（RNA的分離純化及分析）

真核組織總RNA提?。═RIzol試劑法）RNA紫外定性、定量分析及甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的基因PCR及PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定凝膠成像系統(tǒng)的應(yīng)用（示教）基因工程技術(shù)基本實(shí)驗(yàn)利用感受態(tài)細(xì)菌（DH5a）進(jìn)行重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、Amp瓊脂平板篩選利用陽性克隆菌（單菌落）進(jìn)行質(zhì)粒的小量擴(kuò)增質(zhì)粒DNA提?。▔A裂解法）質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶切及酶切片段非變性

PAGE鑒定第4頁/共91頁2011級(jí)碩士研究生分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程表日期2011.9授課內(nèi)容9.99.169.23I．核酸的分離純化、鑒定與分析

及在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用A．DNA的制備與分析介紹DNA分離純化的原則、分析鑒定方法及研究新進(jìn)展真核細(xì)胞基因組DNA的分離純化(蛋白酶K法)DNA的紫外定性、定量分析及瓊脂糖凝膠電泳鑒定II．基因工程基本原理、流程及應(yīng)用A．感受態(tài)細(xì)胞制備、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、陽性克隆擴(kuò)增概述基因工程基本流程利用感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、平板篩選利用陽性克隆菌進(jìn)行質(zhì)粒的小量擴(kuò)增9.109.179.24B．基因表達(dá)水平分析的原理與方法（RNA的分離純化及分析）介紹RNA分離純化的原則、要點(diǎn)、條件、分析方法及新進(jìn)展TRIzol試劑提取真核組織總RNARNA的甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定介紹PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用采用提純的質(zhì)粒DNA進(jìn)行目的基因PCRB．質(zhì)粒DNA的提取、鑒定分析1．介紹質(zhì)粒在基因工程中的應(yīng)用2．質(zhì)粒DNA的堿裂解法提取9.119.189.25PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定凝膠成像系統(tǒng)的應(yīng)用（示教）；質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶切分析；DNA小片段的非變性PAGE考試第5頁/共91頁核酸的分離與純化基本原則：1、保證一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性，完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是研究核酸結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)；2、排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他分子的污染。第6頁/共91頁真核核酸提取的主要步驟

來源：真核生物的一切有核細(xì)胞（包括培養(yǎng)細(xì)胞）溫和裂解細(xì)胞，溶解核酸，使核酸與組蛋白分離；采用化學(xué)或酶學(xué)方法去除蛋白質(zhì)、DNA/RNA及其他大分子。第7頁/共91頁Step1Step2Step3Step4細(xì)胞的破碎：物理方法溶脹和自溶化學(xué)方法生物酶降解核酸的純化核酸的濃縮和沉淀核酸的貯存核酸分離提取的主要步驟第8頁/共91頁真核基因組DNA的制備與分析

蛋白酶K－苯酚抽提法分離純化真核細(xì)胞基因組DNADNA的紫外定性、定量分析及瓊脂糖凝膠電泳鑒定第9頁/共91頁

制備基因組DNA是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要步驟。可從新鮮組織、培養(yǎng)細(xì)胞或低溫保存的組織細(xì)胞中提取。常采用EDTA、SDS以及蛋白酶K等試劑作用下破膜、消化細(xì)胞，并使組織蛋白與DNA分子分離，再用酚、氯仿/異戊醇抽提去除蛋白質(zhì)，最后經(jīng)乙醇沉淀而獲得高純DNA。操作中常加入RNase除去RNA，這一方法獲得的DNA可用于Southern分析，還可用于PCR的模板、基因組DNA文庫構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)。通?？傻玫?00～200kb的DNA片段。（一般真核細(xì)胞基因組DNA有107-9bp。）

DNA提取應(yīng)注意（1）防止和抑制DNase對(duì)DNA的降解；（2）盡量減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞。蛋白酶K－苯酚抽提法第10頁/共91頁操作步驟

1．材料處理

新鮮或冰凍組織處理：

⑴取約50～100mg肝組織,剪碎，加組織細(xì)胞裂解液0.5ml勻漿。

⑵將勻漿液轉(zhuǎn)至1.5mlEppendorf管（Ep管）中。(此時(shí)于勻漿液中加入終濃度為20μg/ml的無DNase的RNaseA)。

⑶加5μl蛋白酶K(終濃度100μg/ml)，混勻。

⑷37℃水浴1h后轉(zhuǎn)為50℃水浴3h（裂解細(xì)胞，消化蛋白），經(jīng)常搖動(dòng)。第11頁/共91頁2．室溫下加500μl飽和酚至樣品處理液中，緩慢顛倒混勻10min。3．離心12000rpm×10min,取上層水相到新Ep管中(約450μl)。4．加等體積氯仿/異戊醇（24：1），充分混勻，離心12000rpm×10min，取上層水相(約300μl)到另一Ep管中。5．加1/10體積的3mol/L醋酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇，顛倒混勻。6．離心14000rpm×15min，小心棄上清液。7．沉淀用70%冷乙醇洗滌1-2次，離心收集沉淀DNA,室溫下?lián)]發(fā)乙醇(勿使DNA完全干燥)。8．沉淀DNA加50-100μlTE緩沖液溶解，－20℃保存或直接分析.操作步驟

第12頁/共91頁標(biāo)本必須新鮮，提取前細(xì)胞應(yīng)保持完整。所用Ep管、滴頭等用品及ddH2O、試劑等應(yīng)高壓滅菌，操作盡量在4℃以下進(jìn)行?；靹蛟噭?、吸取上清液等操作時(shí)應(yīng)避免動(dòng)作劇烈。棄去乙醇時(shí)動(dòng)作應(yīng)輕，切忌甩干，以免DNA丟失。37%以上濃度的異丙醇或者70%以上濃度的乙醇可選擇性沉淀DNA，一般不需在低溫條件下長時(shí)間放置。其缺點(diǎn)是易使鹽類與DNA共沉淀；所以常規(guī)需要70%乙醇漂洗DNA沉淀物。室溫下放置16h或65℃放置1h，可加快基因組DNA沉淀的溶解。注意事項(xiàng)第13頁/共91頁核酸的鑒定與分析紫外分光光度法可用于確定核酸的濃度及純度。核酸的分級(jí)分離。層析技術(shù)及凝膠電泳法，凝膠電泳分離法分制備型和分析型，根據(jù)分離核酸片段的大小可選擇不同參數(shù)或條件的瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳。核酸雜交技術(shù)用于鑒別某個(gè)特定的片段。多聚酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）對(duì)目的基因進(jìn)行DNA序列分析及鑒定。DNA測(cè)序基因表達(dá)分析:（RNA詳細(xì)結(jié)構(gòu)和數(shù)量的分析）第14頁/共91頁DNA的鑒定一、紫外法測(cè)DNA的純度及濃度原理

組成核酸的嘌呤嘧啶堿基均有紫外吸收特性，最大吸收峰在260nm，這是紫外測(cè)定核酸的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。OD值為1時(shí)相當(dāng)于大約50μg/ml雙鏈DNA。通過測(cè)定A260和A280的比值可估算核酸的純度。紫外法僅用于測(cè)定濃度大于0.25μg/ml的核酸溶液。第15頁/共91頁操作

取15μlDNA樣品溶于雙蒸水至3ml，分別于260、280、230nm處比色并記錄。定量分析：

DNA＝A260×核酸稀釋倍數(shù)×50/1000純度分析：

DNAA260/A280=1.8A260/A280>1.8，有RNA雜質(zhì)，用RNase消化；A260/A280<1.7,有雜蛋白，重復(fù)抽提純化步驟;A260/A230<2.0，可能有鹽未除盡。注：此法不能區(qū)分DNA和RNA，不能用于核酸粗制品的測(cè)定。第16頁/共91頁核酸凝膠電泳－核酸的分級(jí)分離核酸是帶均勻負(fù)電荷的分子，在電場中向正極移動(dòng)，不同大小和構(gòu)象的核酸分子的電荷密度大致相同。以適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持介質(zhì)，具有分子篩效應(yīng)，使得分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大差異，達(dá)到分離的目的，此為分離、鑒定和純化核酸片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。第17頁/共91頁

影響核酸電泳的因素

1核酸的性質(zhì)核酸的電荷量，分子大小，分子的空間構(gòu)象等2凝膠孔徑的大小

瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel,PAG)是核酸凝膠電泳常使用的支持材料，表7-1列出不同凝膠濃度與其對(duì)應(yīng)DNA分子的分離范圍。3電場強(qiáng)度和電場方向

低電壓時(shí)，線狀DNA片段的電泳遷移率與電壓成正比。

4電泳環(huán)境

緩沖液的組成和離子強(qiáng)度直接影響遷移率。常用有三種，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE的DNA分離效果好，TAE緩沖容量低，但便宜。緩沖液中的EDTA可螯合二價(jià)陽離子，從而抑制DNA酶的活性.第18頁/共91頁核酸電泳的指示劑與染色劑核酸電泳常用的指示劑有溴酚蘭和二甲苯青

溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，在1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的dsDNA片段大致相同.

二甲苯青的水溶液呈蘭色，它在1%和1.4%瓊脂糖中電泳時(shí)，其遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA大致相似.指示劑一般與甘油、蔗糖或聚蔗糖400組成上樣緩沖液.上樣緩沖液的作用有①增加樣品密度(比重)，使DNA沉入加樣孔內(nèi).②在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可推測(cè)核酸電泳的速度和位置.③使樣品溶液呈色，使加樣操作更直觀方便。核酸電泳后需染色后才能顯現(xiàn)出帶型，最常用的是溴化乙錠染色法，其次是銀染色.

溴化乙錠(ethidiumbromide，EB)是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出桔紅色熒光。銀染色：銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，可將核酸帶染成黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色.第19頁/共91頁瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法.瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物.根據(jù)瓊脂糖的溶解溫度，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖.低熔點(diǎn)瓊脂糖熔點(diǎn)為62～65℃，溶解后在37℃下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時(shí)，主要用于DNA片段的回收，質(zhì)粒與外源性DNA的快速連接等.第20頁/共91頁二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳

原理DNA分子帶負(fù)電荷，在電場中受到電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)向正極移動(dòng)過程中,因DNA分子的大小及構(gòu)象差別而呈現(xiàn)遷移位置上的差異，對(duì)于線形DNA分子，其電場中的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)值成反比。電泳時(shí)加溴化乙錠（EB），其與DNA結(jié)合形成一種熒光絡(luò)合物，在254~365nm紫外線照射下可產(chǎn)生桔紅色的熒光，可用于檢測(cè)DNA。DNA的鑒定分析第21頁/共91頁【操作步驟】1．瓊脂糖凝膠板的制備：將1%~2%瓊脂糖凝膠加熱溶化均勻，冷卻到60~70℃，倒入凝膠槽，厚度約3~5mm，放置樣品梳，待冷卻成形后取出梳子及隔板，放入水平電泳槽中，緩沖液淹沒過膠1~2mm為止。2．加樣：樣品中加1/5體積的6×凝膠上樣緩沖液混勻，取15μl加入凝膠點(diǎn)樣孔中。同時(shí)要設(shè)立合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物。3．電泳：電壓2~10V/cm膠,待溴酚藍(lán)移至凝膠的2/3距離時(shí)，關(guān)閉電源。4．取出凝膠，浸于0.5μg/mlEB溶液中染色20～30min后,置紫外透射反射分析儀上觀察，即可見桔紅色的DNA區(qū)帶。第22頁/共91頁【注意事項(xiàng)】1．加樣時(shí)勿破壞樣品孔，否則DNA帶型不整齊。2．上樣緩沖液中適量的甘油，蔗糖或聚蔗糖400可增加樣品密度，使樣品均勻沉到樣孔底，而溴酚藍(lán)、二甲苯青可使樣品帶色，便于上樣及估計(jì)電泳時(shí)間和判斷電泳位置。3．EB是一種強(qiáng)烈誘變劑并有中度毒性，應(yīng)戴手套操作，對(duì)于含有EB的溶液用后應(yīng)妥善凈化處理。4．EB也可預(yù)加在凝膠中或上樣緩沖液中進(jìn)行DNA電泳時(shí)的同步染色，但EB是帶正電荷的分子，電泳時(shí)向陰極移動(dòng)，會(huì)影響DNA的實(shí)際遷移率。若延長DNA電泳時(shí)間，EB會(huì)從凝膠中遷移出來，從而使小片段DNA難于檢測(cè)，可將凝膠浸在0.5μg/mlEB溶液中重新染色后檢測(cè)。5．加樣孔的加樣量依DNA樣品中片段的數(shù)量及大小而定，通常對(duì)0.5cm寬的加樣孔，DNA上樣量在0.1~0.5μg即可有良好的觀察效果。6．小的凝膠——微型和中型凝膠的電泳一般比大凝膠要快，常用于快速分析。小膠通常要在高電壓下電泳(＞10V/cm)。應(yīng)注意電泳槽盛裝緩沖液的體積要相對(duì)較大。第23頁/共91頁第24頁/共91頁真核細(xì)胞RNA的制備與分析

真核組織總RNA提取(TRIzol試劑法)RNA紫外定性、定量分析甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定第25頁/共91頁抑制RNase活性是提取RNA的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)中嚴(yán)格控制內(nèi)源性和外源性RNase的污染。RNase可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。外源性RNase存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用的RNase也會(huì)造成污染。這些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。各種組織和細(xì)胞中則含有大量內(nèi)源性的RNase。

RNA操作中的要求第26頁/共91頁玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時(shí)間。塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1%DEPC，在37℃處理12hr以上，然后用高壓法除去DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)中手套要勤換。設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。防止RNA酶污染的措施第27頁/共91頁焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。高溫條件下分解。異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。

常用的RNA酶抑制劑第28頁/共91頁RNA的分離和純化-TRIzol試劑法原理首先用含有異硫氰酸胍和酚的一種單相液來裂解細(xì)胞，加入氯仿產(chǎn)生第二相，離心后，RNA存在于水相。經(jīng)異丙醇沉淀水相中的RNA可用于Northern雜交分析、RT-PCR等；存在于有機(jī)相的DNA和蛋白質(zhì)用乙醇和異丙醇連續(xù)沉淀而分別分離，得到的DNA大小約20Kb，適用于PCR的模板；回收的蛋白質(zhì)主要用于免疫印跡分析。第29頁/共91頁取150-200mg鼠肝組織置勻漿器中，加2mlTrizol冰上勻漿，將勻漿液1ml轉(zhuǎn)至Ep管中，靜置５min。加入0.3ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。4℃離心，12000rpm×15min，取上清<0.4ml轉(zhuǎn)入新Ep管。勿觸動(dòng)中下層（沉淀可用于DNA提純）加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。4℃離心，12000rpm×10min，棄上清。加入1ml75%乙醇，輕輕洗滌沉淀,10000rpm×5min，4℃，棄上清。晾干，加入50μl雙蒸水溶解。（15μl用于紫外測(cè)定；10μl用于變性電泳）操作步驟第30頁/共91頁RNA的鑒定一、紫外法定性、定量分析

260nm下OD值為1時(shí)相當(dāng)于40μg/mlRNA。取12μlRNA樣品溶于雙蒸水至3ml，分別于260、280、230nm處比色并記錄。定量分析：RNA＝A260×核酸稀釋倍數(shù)×40/1000（μg/ml）純度分析：A260讀數(shù)在0.15-1.0之間才可靠。RNAA260/A280=1.9-2.1A260/A280<1.9，有雜蛋白，用酚/氯仿抽提;A260/A230<2.0，可能有鹽未除盡。做RT前必需測(cè)RNA濃度，常用500ng或1ug第31頁/共91頁二、RNA的甲醛變性凝膠電泳

原理在核苷酸堿基配對(duì)抑制劑甲醛、甲酰胺或尿素存在的情況下，RNA的遷移率和堿基的組成和構(gòu)象無關(guān)，其電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈反比關(guān)系?？捎糜赗NA的分離、Northern雜交、測(cè)定RNA的長度及回收寡核苷酸。第32頁/共91頁配制1％瓊脂糖變性凝膠：5×MOPS︰2％瓊脂糖凝膠︰甲醛＝1.1︰3.5︰1制備變性的RNA（μl）RNA4.5μl;5×MOPS2.0μl；甲醛3.5μl;甲酰胺10.0μl；65℃溫育15min，置冰浴10min，離心使樣品集中；加2μl10×甲醛凝膠上樣緩沖液；預(yù)電泳，加樣，90V電泳1h；染色，將凝膠置于0.5μg/ml的EB溶液中浸泡30－40min，于紫外下觀察RNA區(qū)帶。操作步驟第33頁/共91頁電泳結(jié)果

100mg動(dòng)物肌肉組織經(jīng)過總RNA提取,用2.5μg進(jìn)行RNA甲醛變性膠電泳結(jié)果。

電泳結(jié)果可檢測(cè)RNA的完整性，28S和18S真核細(xì)胞的比值約為2:1，表明無RNA降解，由下至上分別為

5S、18S和28S的RNA。第34頁/共91頁第35頁/共91頁P(yáng)CR技術(shù)PCR(Polymerasechainreaction)

是用一對(duì)寡聚DNA作為引物，通過加溫變性－退火－DNA合成這一周期的多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴(kuò)增。由于這種擴(kuò)增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的，經(jīng)25－30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)106。

Dr.KarryMullis1985年發(fā)明，獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)目的:

用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。第36頁/共91頁第37頁/共91頁1.TaqDNA聚合酶：水生棲熱菌(thermusaquaticus,Taq)的DNA聚合酶①5’3’DNA聚合酶活性；②無3’5’外切酶活性，

35輪0.25%錯(cuò)配，與原始模板有差別；最適聚合酶溫度72℃，選擇72℃延伸半衰期：92.5℃130min95℃40min97.5℃5—6min

變性溫度：≤95℃使其在整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性基本要素第38頁/共91頁人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，

Tm值要相近，每條引物10-50pmol/100l

◆設(shè)計(jì)原則：

1.Primer與雙鏈DNA鏈互補(bǔ)2.Primer不要出現(xiàn)內(nèi)部互補(bǔ)序列;(形成loop環(huán)，內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu))

3.注意減少Primer間互補(bǔ)序列;(一般不要超過3個(gè)互補(bǔ)bp,否則導(dǎo)致Primer形成dimer)

4.Primer5’未端可修飾、突變;5.Primer5’端增加堿基:①內(nèi)切酶識(shí)別點(diǎn);

②ATG起始密碼;③TAA、TAG、TGA終止密碼

2.引物第39頁/共91頁可選：DNAmRNA→逆轉(zhuǎn)錄→cDNADNA包括：質(zhì)粒噬菌體染色體DNA

較小較大①目的gene是單拷貝變性較易變性較難②非常大，變性難模板用量:

Plasmid:lng;Chromosome:300-500ng

注意：防止交叉污染3.模板第40頁/共91頁4.dNTP：四種脫氧核苷酸終濃度：50M注意：不穩(wěn)定，保存時(shí)間長會(huì)失效5.Mg2+DNA聚合酶作用時(shí)需要Mg2+,不同的酶需不同濃度Mg2+Taq：0.5-1.5mM終濃度，Mg2+

對(duì)反應(yīng)影響很大，pfu：Mg2+2-3mM，dNTP、Primer用量約增加一倍外界影響：

EDTA鰲合Mg2+,應(yīng)選低濃度TE(10mMTris,1mMEDTA)；DNA模板、引物和dNTP的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+

結(jié)合，降低Mg2+有效濃度,如果擴(kuò)增產(chǎn)物或效率不理想時(shí)，要注意調(diào)整合適的Mg2+濃度.第41頁/共91頁（1）變性溫度：94-95℃Templete：GC比例高、長度很長，則變性T↑（2）退火：溫度越高，擴(kuò)增特異性越好取決于Tm值：Tm↑退火T↑；

Tm↓退火T↓若Tm較高，可使退火和延伸在同一溫度(3）延伸：500nt1min500nt－－3min一般：40－60sec6.溫度和時(shí)間：第42頁/共91頁P(yáng)CR擴(kuò)增目的基因（以質(zhì)粒DNA為模板）

總體積50μl滅菌雙蒸水30μl10xTaqbuffer5μl

dNTP2μl

上游引物3μl下游引物3μlDNA模板1μlTaq酶2μlMg2+4μl2000rpm離心20secPCR過程950C，5min變性：950C，30sec退火：580C，45sec延伸：720C，1min30個(gè)循環(huán)END：720C，5min40C，--將PCR產(chǎn)物置于-200C冰箱凍存！第43頁/共91頁第44頁/共91頁基因工程技術(shù)基因工程對(duì)不同生物的遺傳物質(zhì)--基因，在體外進(jìn)行剪切、組合和拼接，使遺傳物質(zhì)從新組合然后通過載體（質(zhì)粒、噬菌體或病毒等）轉(zhuǎn)入微生物、植物或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行無性繁殖，并使所需要的基因在細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的產(chǎn)物或組建成新的生物類型。第45頁/共91頁分——分離出帶有目的基因的DNA片段。切、接——將含目的DNA片段連接到載體分子上。轉(zhuǎn)——將重組DNA分子轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞、增殖。篩——篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。從這些篩選出來的受體細(xì)胞克隆中提取已擴(kuò)增的目的基因，并做序列分析等鑒定。將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入宿主細(xì)胞表達(dá)外源蛋白?；蚬こ碳夹g(shù)第46頁/共91頁基因工程操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定測(cè)序、PCR等第47頁/共91頁基因工程相關(guān)知識(shí)及原理質(zhì)粒(Plasmid)質(zhì)粒是獨(dú)立于染色體外的環(huán)狀雙鏈DNA分子。大小可為1kb到200kb，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。其復(fù)制和遺傳獨(dú)立于細(xì)菌染色體，但依賴于宿主細(xì)胞復(fù)制的酶系。第48頁/共91頁質(zhì)粒超螺旋結(jié)構(gòu)第49頁/共91頁質(zhì)粒類型質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類型：松弛型質(zhì)粒：質(zhì)粒的復(fù)制在寄主細(xì)胞松弛的控制下，不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，而依賴于宿主提供的酶。每個(gè)細(xì)胞中含有10-200份拷貝。松弛型質(zhì)粒的復(fù)制即使蛋白質(zhì)合成受抑制，質(zhì)粒的復(fù)制依然進(jìn)行。當(dāng)抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素等抗生素存在時(shí)，質(zhì)粒的拷貝數(shù)可達(dá)2000-3000拷貝。如較早的質(zhì)粒pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒。嚴(yán)緊型質(zhì)粒：質(zhì)粒復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)格控制下，需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，與寄主細(xì)胞的復(fù)制耦聯(lián)同步。往往在一個(gè)細(xì)胞中只有一份或幾份拷貝。第50頁/共91頁質(zhì)粒在基因工程中的應(yīng)用大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒用來表達(dá)一些可使宿主細(xì)胞受毒害致死的基因。質(zhì)粒的特點(diǎn)使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值。第51頁/共91頁質(zhì)粒載體(Vector)：用于攜帶重組DNA，并且能夠使外源DNA一起復(fù)制與表達(dá)的質(zhì)粒(運(yùn)載工具)。具備的條件：易于鑒定、篩選(具有篩選標(biāo)志)；在受體細(xì)胞中可以獨(dú)立復(fù)制；具有MCS（多克隆位點(diǎn)）；易于導(dǎo)入受體細(xì)胞。第52頁/共91頁抗性基因（Antibioticresistancegene,suchasAmpicillinresistancegene,Kanamycineresistancegene)啟始復(fù)制子(

ori,Originofreplication)；多克隆位點(diǎn)(MCS,Multiplecloningsiteorpolylinker)；標(biāo)記基因(Markergene,suchasLacZgene)。載體的結(jié)構(gòu)第53頁/共91頁InsertEcoRIXhoI1.9kb第54頁/共91頁感受態(tài)細(xì)菌制備、轉(zhuǎn)化及Amp瓊脂板篩選基因工程技術(shù)基本實(shí)驗(yàn)第55頁/共91頁實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵髮W(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞的技術(shù)以及篩選轉(zhuǎn)化體的技術(shù)。了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義。第56頁/共91頁感受態(tài)細(xì)菌制備及轉(zhuǎn)化原理

在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi)，但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因，不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。第57頁/共91頁感受態(tài)細(xì)胞(Competentcells)受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2，RbCl等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能攝取異源DNA的受體細(xì)胞，即感受態(tài)細(xì)胞。受體細(xì)胞：原核大腸桿菌真核酵母菌、動(dòng)物、昆蟲細(xì)胞第58頁/共91頁重組DNA導(dǎo)入宿主的方法轉(zhuǎn)化transformation轉(zhuǎn)染transfection微注射技術(shù)microinjection電轉(zhuǎn)化法electrotransformation電穿孔法electroproration微彈技術(shù)(基因槍技術(shù))脂質(zhì)體介導(dǎo)法第59頁/共91頁轉(zhuǎn)化（transformation）是將異源DNA分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制－修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。第60頁/共91頁

轉(zhuǎn)化的方法：化學(xué)的方法(熱擊法)：使用化學(xué)試劑（如CaCl2）制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過熱擊處理將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。第61頁/共91頁轉(zhuǎn)化子(transformant)是指接受外源DNA后獲得新的遺傳標(biāo)志的細(xì)菌細(xì)胞或其他受體細(xì)胞。重組體篩選直接篩選間接篩選DNA鑒定篩選法選擇性載體篩選分子雜交選擇法質(zhì)粒提取及內(nèi)切酶圖譜鑒定PCR篩選重組子DNA測(cè)序α-互補(bǔ)(色斑法)法抗藥性標(biāo)志選擇標(biāo)志補(bǔ)救原位雜交(菌落)Southernblotting免疫學(xué)方法表達(dá)產(chǎn)物免疫印跡法免疫沉淀法酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析其他方法mRNA翻譯檢測(cè)網(wǎng)織紅細(xì)胞液法蛙卵細(xì)胞法第62頁/共91頁

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法)

1.取出液氮或低溫冰箱中貯存的EcoliDH5α菌在LB瓊脂平板上劃線，37℃過夜至長出單菌落。2.挑選瓊脂培養(yǎng)平板上的單菌落,接種到含有3m1LB培養(yǎng)基的試管內(nèi)，37℃振搖過夜。次日取菌液1m1接種至含有100m1LB培養(yǎng)基的500m1燒瓶中，37℃劇烈振搖（200~300rpm）培養(yǎng)約2~3h，待OD600值達(dá)到0.3~0.4時(shí)將燒瓶取出立即置冰浴10~15min。操作步驟第63頁/共91頁將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)預(yù)冷的1.5ml滅菌的離心管中。于4℃離心，8000g×1min回收細(xì)胞。棄去上清，將管倒置于濾紙上1min。加1ml4℃預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2重懸菌體，冰浴30分鐘。

4℃離心1min,回收菌體。棄去上清，將管倒置于濾紙上1min。加0.1ml4℃預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2重懸菌體，置4℃冰箱過夜。即可應(yīng)用于轉(zhuǎn)化。以下皆需無菌、冰上操作第64頁/共91頁制備含100μg/mlAmp的固體LB瓊脂平板(50℃時(shí)加入Amp)；取100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液于新Ep管中進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：加入5μl重組質(zhì)粒DNA輕輕搖勻，冰上放置30min；42℃熱休克90sec(勿超時(shí)!)，冰浴速冷1-2min。加入無抗生素的LB培養(yǎng)液400μl混勻，于37℃搖床溫和振搖(150～200rpm)45-60min;(細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒的抗性基因)平板培養(yǎng):取樣品培養(yǎng)液0.1ml，接種于含Amp的LB瓊脂平板上，涂勻（用無菌玻璃鋪菌器涂抹）。菌液完全被培養(yǎng)基吸收后(37℃平放20min），倒置培養(yǎng)皿，于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜(12～16h),生長出的克隆即為轉(zhuǎn)化成功的菌落。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化第65頁/共91頁注意事項(xiàng)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中陽性對(duì)照，以估計(jì)轉(zhuǎn)化條件和效率；陰性對(duì)照，以消除可能的污染及便于查明原因。如陰性對(duì)照出現(xiàn)克隆，可能原因：1、感受態(tài)細(xì)胞被有抗生素抗性的菌株污染；2、選擇性平板失效；3、選擇性平板被某種具有抗生素抗性的菌株污染。如果陽性對(duì)照沒有克隆長出，說明感受態(tài)細(xì)胞或轉(zhuǎn)化緩沖液有問題。細(xì)胞生長狀態(tài)和密度:DH5α菌株的OD600為0.5時(shí),細(xì)胞密度在5×107個(gè)/ml左右質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度:DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒主要是共價(jià)閉環(huán)DNA(cDNA)，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比。防止雜菌和雜DNA的污染：無菌條件第66頁/共91頁氨芐青霉素抗性菌落數(shù)的增加與平皿上所加細(xì)菌數(shù)的增加并無線性比例關(guān)系，這可能是因?yàn)楸豢股貧⑺赖募?xì)胞可釋放生長抑制物質(zhì)的緣故。如檢查Amp抗性，用轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪平板時(shí)密度應(yīng)較低(每個(gè)90mm平板不超過104菌落)于37℃培養(yǎng)平板時(shí)不應(yīng)超過20h。Amp抗性的轉(zhuǎn)化體可將β-內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周圍區(qū)域中的抗生素。這樣，鋪平板時(shí)密度太高或培養(yǎng)時(shí)間太長都會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)對(duì)Amp敏感的衛(wèi)星菌落。第67頁/共91頁小量菌液的培養(yǎng)挑選瓊脂培養(yǎng)平板上的單菌落,接種到含有3mLLB（含Amp）培養(yǎng)基的試管或錐形瓶內(nèi)，37℃振搖過夜。第68頁/共91頁質(zhì)粒DNA提取的步驟1培養(yǎng)細(xì)菌質(zhì)粒擴(kuò)增2收集與裂解細(xì)菌3質(zhì)粒DNA的純化第69頁/共91頁DNA是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致DNA的變性，如加熱、極端pH值、有機(jī)溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)境又可以使DNA復(fù)性。純化質(zhì)粒DNA的方法常利用質(zhì)粒DNA相對(duì)較小及共價(jià)閉環(huán)的性質(zhì)。如氯化銫-EB梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級(jí)沉淀等方法。實(shí)驗(yàn)室中小量制備質(zhì)粒DNA，經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標(biāo)記等?；驹恚旱?0頁/共91頁細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取方法：

堿裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于質(zhì)粒大量提取。第71頁/共91頁質(zhì)粒DNA的小量提取堿裂解法SDS是一種陰離子表面活性劑，既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使蛋白質(zhì)變性，經(jīng)SDS、EDTA處理后細(xì)菌細(xì)胞壁破裂，質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細(xì)胞中釋放出來，遇到強(qiáng)堿性pH12.0(NaOH)環(huán)境均變性。用酸性乙酸鉀中和溶液，并在高濃度鹽存在的條件下，質(zhì)粒DNA將迅速復(fù)性呈溶解狀態(tài)，而染色體DNA由于分子巨大，難以復(fù)性，交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而與蛋白質(zhì)易形成沉淀。離心后，質(zhì)粒DNA存于上清中，而基因組DNA則與細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)一起沉淀到離心管的底部。再進(jìn)一步經(jīng)苯酚、氯仿抽提和乙醇沉淀等純化質(zhì)粒DNA。第72頁/共91頁培養(yǎng)細(xì)菌：將含質(zhì)粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜(12～16h);取培養(yǎng)菌液1.5-3ml于Ep管中，離心10000rpm×30s,棄上清；加100l預(yù)冷的溶液I，充分振蕩重懸菌體，冰上放置5min;加入200l新配制的0.2mol/LNaOH+1％SDS(溶液II-變性液)，加蓋顛倒6-7次混勻(不要?jiǎng)×艺袷?，冰上放置3-5min(勿超時(shí))加入150ul預(yù)冷的乙酸鉀溶液(溶液III),蓋后顛倒6-7次混勻，冰上放置5min;12000rpm離心10min，上清<400ul移入新Ep管.加入等體積平衡酚混勻，離心12000rpm×5min，轉(zhuǎn)上清液至新Ep管中。加入等體積氯仿/異戊醇（24：1）抽提一次，離心12000rpm×5min，轉(zhuǎn)上清液至新Ep管中。加RNaseA2-5μl,混勻，置37℃水浴30min。加等體積氯仿/異戊醇(24:1)抽提一次，離心10000rpm×5min，轉(zhuǎn)上清至新Ep管中。加1/10體積的NaAC和2.5倍100％冰乙醇混勻，14000rpm離心10min，棄上清;沉淀用1ml70％預(yù)冷的乙醇清洗一次，12000rpm離心5min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干。加50μlTE溶解沉淀。1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取質(zhì)量,或-20℃保存?zhèn)溆没蜻M(jìn)行RE酶切實(shí)驗(yàn)。堿裂解法實(shí)驗(yàn)步驟

第73頁/共91頁注意：用移液器操作時(shí)，每一步都要格外小心，特別是在加入溶液II和III后，一定不要?jiǎng)×艺袷帲悦馇兴镈NA(包括質(zhì)粒DNA和基因組DNA)?。?！第74頁/共91頁

重組質(zhì)?？寺〉蔫b定鑒定帶有重組質(zhì)?？寺〉姆椒ǔＳ玫挠?互補(bǔ)、小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法。最常用的方法是小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析，對(duì)于帶有LacZ基因的載體還可以結(jié)合-互補(bǔ)現(xiàn)象來篩選。第75頁/共91頁

重組DNA的酶切分析目的基因非變性PAGE鑒定第76頁/共91頁實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵髮W(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的特性、酶切分析和DNA非變性PAGE鑒定的操作方法，并理解限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)的關(guān)鍵工具，非變性PAGE是高分辨率分離鑒定小分子雙鏈DNA片段的有效方法。第77頁/共91頁限制性核酸內(nèi)切酶(RestrictionEndonuclease，RE)：是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。是體外剪切基因片段的重要工具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。RE不僅是DNA重組中重要的工具，而且還可以用于基因組酶切圖譜的鑒定。第78頁/共91頁1)寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象2)核酸限制性內(nèi)切酶的類型、命名法3)核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性4)同裂酶和同尾酶5)影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素第79頁/共91頁1)

寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象限制與修飾系統(tǒng)是細(xì)胞的一種防衛(wèi)手段。各種細(xì)菌都能合成一種或幾種核酸內(nèi)切酶，用來限制外源DNA存在于自身細(xì)胞內(nèi)，但細(xì)胞自身的DNA不受影響，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)還合成了一種修飾酶，能對(duì)自身的DNA進(jìn)行修飾，限制性酶對(duì)修飾過的DNA不能起作用。這種現(xiàn)象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。第80頁/共91頁2)限制性核酸內(nèi)切酶的類型及特性按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系以及切斷核酸的情況不同，分為三類：Ⅰ型:隨