可移動的遺傳因子第1頁/共66頁2023/3/102第一節(jié)轉(zhuǎn)座子p68原核和真核生物基因組中的可以從一個部位轉(zhuǎn)移到另一個部位的DNA序列，這些序列稱為轉(zhuǎn)座子(Transposon)第2頁/共66頁3BarbaraMcClintock

1902-1992B.MClintock于上個世紀40年代晚期在玉米中首次發(fā)現(xiàn)的。60年代，為J.A.Shapirc研究大腸桿菌高效突變實驗證實。1983年榮獲諾貝爾生物學醫(yī)學獎。第3頁/共66頁2023/3/104轉(zhuǎn)座子能夠直接或間接地促進基因組的重排，轉(zhuǎn)座作用能引起DNA序列缺失、倒位或?qū)⑺拗鞯男蛄幸苿拥叫挛稽c，因此轉(zhuǎn)座子是原核或真核生物基因組內(nèi)突變的主要來源。第4頁/共66頁2023/3/105轉(zhuǎn)座方式有復制轉(zhuǎn)座和非復制轉(zhuǎn)座，大多數(shù)的轉(zhuǎn)座方式為復制轉(zhuǎn)座（即轉(zhuǎn)座子的一個新的拷貝插入新的位點時，另一個拷貝仍留在原始位點）根據(jù)轉(zhuǎn)座機制轉(zhuǎn)座子可分為：轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子拷貝:copy的音譯第5頁/共66頁2023/3/106MobileelementsViralfamilyWithLTRsNonviralfamilyWithoutLTRsBacterialISelementBacterialtransposonFruitflyPelementCornAcelementYeastTyelementFruitflycopiaelementSINEs(eg:Alufamily)LINEsThroughRNA(逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子)ThroughDNA(轉(zhuǎn)座子)WithoutreversetranscriptaseWithreversetranscriptase第6頁/共66頁2023/3/107一、轉(zhuǎn)座子分類和結(jié)構(gòu)特征轉(zhuǎn)座子都有一個保守結(jié)構(gòu)，有一個或多個開放閱讀框，兩側(cè)是反向末端重復序列（invertedterminalrepeats,ITR）轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)特征:轉(zhuǎn)座酶識別的底物轉(zhuǎn)座子的共同特點有：兩端有末端反向重復序列轉(zhuǎn)座后靶位點重復是正向重復編碼與轉(zhuǎn)座有關(guān)的蛋白可以在基因組中移動第7頁/共66頁反向倒轉(zhuǎn)重復序列GGAAGGT、、、ACCTTCCCTTCCA、、、TGGAAGG反向重復序列GGAAGGT、、、TGGAAGGCCTTCCA、、、ACCTTCC正向重復序列TACGTTACGT2023/3/108第8頁/共66頁2023/3/109原核生物的轉(zhuǎn)座子的種類：插入序列Insertionsequence,IS復合轉(zhuǎn)座子Compositetransposon轉(zhuǎn)座子A家族TransposonA,TnA轉(zhuǎn)座噬菌體Mu噬菌體第9頁/共66頁2023/3/1010（一）插入序列IS末端含反向重復序列識別的靶點大多5-9bp含編碼轉(zhuǎn)座酶基因TSTransposasegeneTSIRIRTStargetsite靶位點Transposasegene轉(zhuǎn)位酶基因IRinvertedrepeated反向（倒轉(zhuǎn)重復順序）第10頁/共66頁2023/3/1011（二）復合轉(zhuǎn)座子

1.中間為標記基因

2.兩側(cè)臂是兩個同向重復或反向重復的IS序列復合轉(zhuǎn)座子的臂稱為IS或類IS組件IS的末端反向重復第11頁/共66頁2023/3/1012（三）轉(zhuǎn)座子A家族長約5kb,兩端長約38bp的反向重復攜帶抗性基因和轉(zhuǎn)座酶基因攜帶編碼轉(zhuǎn)座酶和解離酶基因tnpA編碼轉(zhuǎn)座酶tnpR編碼解離酶Res解離的控制位點第12頁/共66頁2023/3/1013（四）轉(zhuǎn)座噬菌體——Mu噬菌體,phageMu包括Mu和D108兩種噬菌體，是一類溫和噬菌體，線狀DNA游離態(tài)和整合態(tài)有相同的基因次序，末端不含反向重復序列侵入的Mu可在溶源化過程插入寄主DNA任意部位，造成靶點倍生，原噬菌體兩側(cè)各有一個5bp的靶點重復序列Bar=50nanometers原噬菌體:prophage,整合入宿主DNA中的噬菌體第13頁/共66頁2023/3/1014真核生物轉(zhuǎn)座子（了解）真核細胞內(nèi)只要存在轉(zhuǎn)座酶，任何序列片段具有該酶識別的反向重復末端均可發(fā)生轉(zhuǎn)移最早發(fā)現(xiàn)的是玉米轉(zhuǎn)座子，稱為控制因子通常以非復制方式轉(zhuǎn)座第14頁/共66頁1.復制型轉(zhuǎn)座共聯(lián)體生成和解離，靶序列的切割與復制。2.非復制型轉(zhuǎn)座將供體DNA轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)各切斷一條單鏈并與靶序列的兩個游離末端連接，隨后并沒有復制過程，而是由轉(zhuǎn)座酶將供體DNA轉(zhuǎn)座因子的另一端也切斷，因此在供體DNA留下一個致死性缺口。轉(zhuǎn)座子的兩條游離單鏈在靶位點退火接合，DNA聚合酶填平缺口。二、轉(zhuǎn)座機制第15頁/共66頁2023/3/1016復制型轉(zhuǎn)座包括兩步：轉(zhuǎn)座子本身的復制和基因靶序列的斷裂及倍生1.基因靶序列的斷裂及倍生.ATGCATACGT內(nèi)切酶在靶序列兩邊切出切口靶序列轉(zhuǎn)座子ATGCATACGT轉(zhuǎn)座子ATGCATACGT第16頁/共66頁2023/3/1017Replicativetranspositioncreatesacopyofthetransposon,whichinsertsatarecipientsite.Thedonorsiteremainsunchanged,sobothdonorandrecipienthaveacopyofthetransposon.

復制型轉(zhuǎn)座第17頁/共66頁三、轉(zhuǎn)座的遺傳效應1.基因重排可能產(chǎn)生1個新的蛋白分子等，基因重排是進化的動力。2.基因突變插入到基因內(nèi)部，可引起插入失活。3.插入位點引入新的基因如引進抗藥基因。第18頁/共66頁2023/3/1019

第二節(jié)遺傳重組p88廣義的遺傳重組:減數(shù)分裂時通過同源染色體的交換和非同源染色體的獨立分配，使子代細胞的遺傳信息產(chǎn)生重新組合稱為遺傳重組（geneticrecombination）狹義的遺傳重組:僅指涉及DNA分子內(nèi)的斷裂并重新連接而造成基因重新組合的過程即基因交換遺傳重組是使生物產(chǎn)生遺傳變異的原因之一第19頁/共66頁2023/3/1020遺傳重組的分類

根據(jù)重組過程中涉及DNA序列和蛋白質(zhì)因子的要求不同,將重組分為四類:同源重組(homologousrecombination)位點特異性重組(site-specificrecombination)轉(zhuǎn)座作用(transposition)異常重組(illegitimaterecombination)第20頁/共66頁AA’復制___個DNA___個染色體___個姐妹染色單體___個DNA___個染色體___個姐妹染色單體重溫故知——染色體復制110212第21頁/共66頁同源染色體

精子的頭部卵細胞非同源染色體+受精卵12341和4、2和3真核生物性母細胞有兩套染色體,一套來自于父本,一套來自于母本,兩套染色體中大小、形狀相同的染色體稱為同源染色體如1和3、2和4homologouschromosome)第22頁/共66頁2023/3/1023概念：同源重組指發(fā)生在兩條DNA的同源序列之間,涉及的是大片段同源DNA序列的交換。只要兩條DNA序列相同或相近就可以在序列任一點發(fā)生同源重組.存在:真核生物姊妹、非姊妹染色單體的交換；細菌的轉(zhuǎn)化、接合、噬菌體的轉(zhuǎn)導.特點：參加重組的蛋白質(zhì)因子對重組位點無序列特異性要求.一、同源重組第23頁/共66頁2023/3/1024（一）、同源重組的分子機制

（1）Hollidaymodel 1964年，美國科學家RobinHolliday提出（2）雙鏈斷裂模型Double-strandedBreakModel,DSBmodel

1989年，JackSzostak在酵母和質(zhì)粒研究中發(fā)現(xiàn)兩種模型的區(qū)別：出現(xiàn)斷裂的位點的鏈不同第24頁/共66頁2023/3/1025（1）Hollidaymodel

1.切斷3.分支遷移4.旋轉(zhuǎn)去交叉結(jié)構(gòu)2.交叉5.Holliday中間體拆分1964年，美國科學家RobinHolliday提出交互重組基因組無重組第25頁/共66頁2023/3/1026（2）雙鏈斷裂模型DSBmodel3’端鏈的延伸造成缺口處單鏈置換3’端入侵至另一雙鏈斷裂擴大為含3’端的間隙受體雙鏈DNA斷裂被置換的單鏈遷移至另一雙鏈另外一個游離的3’端鏈延伸雙向遷移兩個交叉點第26頁/共66頁2023/3/1027WhatcausedDSBs?TheycanbecreatedbyProblemsinreplicationEnvironmentaldamage,eg.radiationdamageTheshorteningoftelomeresAlltheycancausemutations,soit’sarecombinationrepair.

Recombinationisanimportantmechanismtorecoverfromreplicationerrors!

第27頁/共66頁2023/3/1028(二)同源重組的酶學

同源重組需要一系列的蛋白質(zhì)催化，如原核生物細胞內(nèi)的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物細胞內(nèi)的Rad51、Mre11-Rad50等等。在所有的同源重組中,對E.coli和phage的研究最為深入.編碼這些蛋白質(zhì)的基因有27種,研究最清楚的是RecBCD,RecA,RuvAB,RuvC第28頁/共66頁2023/3/1029Nature

455,770-774(9October2008)Sae2,Exo1andSgs1collaborateinDNAdouble-strandbreakprocessingEleniP.Mimitou1&LorraineS.Symington1DepartmentofMicrobiology,ColumbiaUniversityMedicalCenter,701West168thStreet,NewYork,NewYork10032,USATheseresultssuggestatwo-stepmechanismforDSBprocessingduringhomologousrecombination.First,theMre11complexandSae2removeasmalloligonucleotide(s)fromtheDNAendstoformanearlyintermediate.Second,Exo1and/orSgs1rapidlyprocessthisintermediatetogenerateextensivetractsofsingle-strandedDNAthatserveassubstrateforRad51.關(guān)于真核細胞內(nèi)蛋白質(zhì)催化的同源重組機制研究第29頁/共66頁2023/3/10301.RecBCD含有三種亞基,具有核酸酶活性、解旋酶活性和ATPase活性:（1）DNA內(nèi)切酶活性,尤其是chi位點附近,單鏈或雙鏈外切酶活性（2）解旋酶活性（3）ATPase活性產(chǎn)生游離的3’末端RecBCD從一端向chi位點移動，一邊降解DNA一邊移動，在chi位點發(fā)揮內(nèi)切酶活性，RecD解離，只保留解旋酶活性。第30頁/共66頁2023/3/10312.RecA又稱為重組蛋白活性:單鏈DNA,雙鏈DNA結(jié)合活性

NTP酶活性促進同源聯(lián)會和鏈入侵Fig.Singlestrandassimilation第31頁/共66頁2023/3/1032（1）RuvAB具解旋酶作用,推動Holliday中間體分支遷移（2）RuvC具有內(nèi)切酶活性,拆分Holliday中間體3.Ruv蛋白Fig.RuvABinbranchmigration第32頁/共66頁2023/3/1033補充說明

同源重組只涉及基因組DNA部分區(qū)域,并非整個染色體參與；當同源序列<75bp時，重組發(fā)生率降低；第33頁/共66頁2023/3/1034二、位點特異性重組p96典型的例子:λphage整合與切離-----原核生物抗體VDJ重排-----真核細胞位點特異性重組(Site-specificrecombination

)指不依賴于DNA序列的同源性,而依賴于能與某些酶相結(jié)合的特異DNA序列的重組.第34頁/共66頁2023/3/1035(一)λphage整合與切離幾點說明:λphage溶源和裂解兩條途徑。Attachmentsite,att附著點,即整合與切離的位點attP,噬菌體,由POP’三部分組成,全長235bpattB,細菌,由BOB’三部分組成,全長23bpO為核心序列,全長15bpProphage:原噬菌體bacteriabacteriaphage第35頁/共66頁2023/3/1036λphage整合與切離發(fā)生DNA序列的重排P’p----B----O----P’---------------P-----O-----B’---第36頁/共66頁2023/3/1037λphage整合需要兩個蛋白

Int,integrase整合酶

IHF,integrationhostfactor

整合宿主因子λphage切離需要三個蛋白

Int,整合酶

IHF,整合宿主因子

Xis,切離酶整合需要識別attP和attB,切離需要識別attL和attR,主要由Xis控制反應的方向 第37頁/共66頁2023/3/1038λphage整合與切離的特點:λDNA和宿主DNA的這種交換是可逆的,過程無DNA的丟失.λDNA和宿主DNA之間有一段很短的同源序列,重組交換必須通過其特定的序列.第38頁/共66頁2023/3/1039(二)抗體VDJ重排

利根川進揭示了抗體基因重排機制，獲1987年Nobel生理學和醫(yī)學獎3-D結(jié)構(gòu)第39頁/共66頁2023/3/1040抗體背景知識針對上百萬或上億萬的外來抗原，人體免疫細胞能產(chǎn)生相應于每種抗原的抗體，按照一個基因一條多肽連的說法是否說人類細胞有如此多的抗體基因呢？第40頁/共66頁2023/3/1041人體有5種主要的重鏈，形成5類免疫球蛋白第41頁/共66頁2023/3/1042IgGIgAIgMIgDIgE人體含量最多的抗體尤其存在于對抗微生物及其毒素的細胞外液人體上皮黏液漿液性分泌物中的主要抗體IgM是最早出現(xiàn)的免疫球蛋白,是抵御細菌的第一道防線主要表達在淋巴細胞表面體表保護性抗體，早期抗微生物抗體，與變態(tài)反應癥狀密切相關(guān)各類免疫球蛋白的生物學的生物學特征第42頁/共66頁2023/3/1043基因工程抗體藥物第43頁/共66頁2023/3/1044抗體(antibody),又叫免疫球蛋白(Immunoglobulin),由四條鏈組成：兩條重鏈，兩條輕鏈.輕鏈有兩種:λ鏈和κ鏈抗體與外來抗原結(jié)合位點稱為可變區(qū)（V區(qū)），決定抗體特異性和多樣性.其他部分稱為恒定區(qū)（C區(qū)），對同一類抗體C區(qū)是不變的抗體的蛋白序列第44頁/共66頁2023/3/1045抗體基因是多基因片段編碼的:V區(qū)抗體輕鏈中主要由V基因編碼，J基因編碼最后12個氨基酸；抗體重鏈中V和J之間還有一些D（diversity）基因片段C區(qū)由C基因編碼1.抗體的基因第45頁/共66頁2023/3/1046抗體基因片段在基因組中的分布FamilyVGenesCGenesManMouseManMouseLambda<3002>64Kappa<300~100011Heavy~300>100098EachimmunoglobulinfamilyconsistsofaclusterofVgeneslinkedtoitsCgene(s).第46頁/共66頁2023/3/1047ThelambdafamilyconsistsofVgenesegmentslinkedtoasmallnumberofJ-Cgenesegments.λ輕鏈基因多樣性—胚系DNA中ThehumanandmousekappafamiliesconsistofVgenesegmentslinkedto5JsegmentsconnectedtoasingleCgenesegment.κ輕鏈基因多樣性—胚系DNA中第47頁/共66頁2023/3/1048Asinglegeneclusterinmancontainsalltheinformationforheavy-chaingeneassembly.抗體重鏈基因多樣性—胚系DNA中第48頁/共66頁2023/3/1049

那么，抗體基因何時發(fā)生重排?

如何重排?

有無規(guī)律可循?第49頁/共66頁2023/3/10502.抗體的重排機制胚系DNA中并不存在每條H鏈和每條L鏈的完整基因,而是在B細胞的早期發(fā)育過程中,通過小段的基因片段拼接而成.如κ輕鏈:一個Vκ和一個Jκ連接成Vκ-Jκ,當B細胞抗體基因被轉(zhuǎn)錄后,細胞核RNA的剪接使得Vκ-Jκ與Cκ相連接.(1)、可變區(qū)重排特點輕鏈重排特點V-J

輕鏈有兩大家族：κ和λ(大部分抗體是κ輕鏈)

重鏈重排特點V-D-J第50頁/共66頁2023/3/1051抗體κ、λ輕鏈可變區(qū)重排過程第51頁/共66頁2023/3/1052D-JV-DV-D-J抗體重鏈可變區(qū)重排過程第52頁/共66頁2023/3/1053a.基因兩旁有保守的共有序列7聚體、9聚體（consensussequence）b.7聚體和9聚體間有非保守的重排信號序列(recombinationsignalsequence,RSS)，12bp或23bpc.重排規(guī)則:12/23規(guī)則，即22bp的信號序列總是與23bp的信號序列連接，從而保證重鏈與輕鏈的正確連接

(2)、重排及重排信號

第53頁/共66頁2023/3/1054232323121212蘭色：7聚體綠色：9聚體重鏈可變區(qū)的VDJ重排第54頁/共66頁2023/3/1055(3)、重組酶

a.重組激活基因，RAG（recombinationactivatinggens）基因編碼的重組酶。RAG-1和RAG-2在Pre-T和Pre-B細胞表達，因此成熟的淋巴細胞不再進行抗原受體基因的重排。

b.TdT（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶）第55頁/共66頁2023/3/1056關(guān)于VDJ重排的總結(jié):抗體的多樣性和抗原結(jié)合的特異性由其可變區(qū)決定,因此重排是指H鏈和L鏈可變區(qū)的重排,重排產(chǎn)生堿基的丟失和增加；重排發(fā)生在DNA水平,而剪接發(fā)生在RNA水平；L鏈可變區(qū)發(fā)生V-J重排,H鏈發(fā)生V-D-J重排；抗體多樣性產(chǎn)生的原因一方面是B細胞成熟前發(fā)生的重排，另一方面是體細胞突變。當一個產(chǎn)生抗體的細胞克隆增殖時，如果遇到外來抗原，將產(chǎn)生抗體基因的突變，從而提供更多種類的抗體，與更多抗原作用。第56頁/共66頁2023/3/1057本章要求概念:轉(zhuǎn)座子,復合轉(zhuǎn)座子,同源重組，位點特異性重組，VDJ重排原核生物轉(zhuǎn)座子的分類和轉(zhuǎn)座特征;遺傳重組的分類；同源重組的分子機制和酶學；噬菌體的整合與切離機制；VDJ重排掌握第57頁/共66頁2023/3/1058遺傳重組在分子生物學中的應用GeneTargeting基因打靶

genetargeting

是利用活細胞染色體DNA可與外源DNA的同源DNA序列發(fā)生重組的性質(zhì)，進行定點修飾，改造染色體上某一目的基因的技術(shù)根據(jù)重組后靶基因變化分為兩類：基因破壞或剔除genedisruptionorknockout基因取代genereplacement補充資料第58頁/共66頁2023/3/10591982年，美國學者Palmiter將大鼠生長激素基因?qū)胄∈笫芫?，所?只子代小鼠中有6只生長加快，體重明顯增加，這就是所謂的“超級小鼠”(supermouse)誕生了?！俺壭∈蟆钡慕⒊晒Z動了整個生命科學界，科學家們對此表現(xiàn)出濃厚的興趣，許多實驗室競相開展這方面的研究工作，因此轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)迅速發(fā)展，不斷完善。transgenicmousewithanactiveratgrowthhormonegene(left)istwicethesizeofanormalmouse(right).Photograph第59頁/共66頁

2007NobelprizeforphysiologyormedicineMarioCapecchioftheHowardHughesMedicalInstituteattheUniversityofUtahSirMartinEvansofCardiffUniversityOliverSmithiesoftheUniversityofNorthCarolina,ChapelHill.GeneTargetinginMice第60頁/共66頁2023/3/1061Independently,bothCapecchiandSmithiesrealizedthathomologousrecombination,itselfthesubjectofthe1958Prize,couldbeusedtorepairdefectivegenes.Thiswasdonebyintroducingacorrectversionofthetargetgeneintothenucleusofacell.MartinEvan'scontributionwastheisolationofthemouseembryonicstemcell(ESC).Bycombiningthetwotechniques,itwasfinallypossibletocreategermlinemutationsthatwouldresultinanewstrainofmicewithaspecificmutation.第61頁/共66頁2023/3/1062Byreplacingacopyofafunctionalgenewithonethatisdamaged,butincludingagenethatconfersresistanceagainsttheantibioticneomycin,itbecamepossibletoselectforthepopulationofcellsthathadsuccessfullybeentransformed.WhentheseESCswereimplantedintofemalemiceandcarrie