//基因工程復(fù)習(xí)歸納第一章緒論1.基因工程的定義：是指按照人們的愿望，經(jīng)過嚴(yán)密的設(shè)計，將一種或多種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體/宿主）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳、并表達(dá)出新的性狀的技術(shù)。2?基因工程概念的發(fā)展：遺傳工程一DNA重組技術(shù)一分子/基因克?。∕olecular/Gene-基因工程一基因操作。應(yīng)用領(lǐng)域以"基因工程"、“DNA重組"為主基因工程基因工程的歷史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重組技術(shù)1978：Genetech公司在大腸桿菌中表達(dá)出胰島素1982：世界上第一個基因工程藥物重組人胰島素上市1988：PCR技術(shù)誕生1989:我國第一個基因工程藥物rhIFNalb上市2003:世界上第一個基因治療藥物重組腺病毒-p53上市基因工程的三大關(guān)鍵元件基因（供體）：外源基因、目的基因載體：能將外源基因帶入受體細(xì)胞，并能穩(wěn)定遺傳的DNA分子（克隆載體、表達(dá)載體）。宿主（受體）：，能攝取外源DNA、并能使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞（組織、器官或個體）?；蚬こ痰幕静襟E（切、接、轉(zhuǎn)、增、檢（大腸桿菌是中心角色）（1）目的基因的獲?。簭膹?fù)雜的生物基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。（2）重組體的制備：將目的基因的DNA片斷插入到能自我復(fù)制并帶有選擇性標(biāo)記（抗菌素抗性）的載體分子上。（3）重組體的轉(zhuǎn)化：將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中。（4）克隆鑒定：挑選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞克隆（含有目的基因）。（5）目的基因表達(dá)：使導(dǎo)入寄主細(xì)胞的目的基因表達(dá)出我們所需要的基因產(chǎn)物。第二章DNA重組克隆的單元操作一、用于核酸操作的工具酶1?限制性核酸內(nèi)切酶（主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來DNA的入侵）。限制性核酸內(nèi)切酶的功能與類型主要特征I型II型III型功能限切/修飾限切限切/修飾蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體單體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMMg2+ATPMg2+SAM識別序列TGAN8TGCT旋轉(zhuǎn)對稱序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位點距識別序列l(wèi)kb處識別序列內(nèi)距識別序列下游24-26bp處其中II型限制性核酸內(nèi)切酶：切割位點專一，適于DNA重組，是DNA重組中最常用工具酶。特點：1.識別、并切割雙鏈DNA分子中特異序列的DNA內(nèi)切酶。2.識別序列為4-6堿基對的回文對稱結(jié)構(gòu)（旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)）。3.單體蛋白、僅有限制性內(nèi)切酶活性，無甲基化酶活性。4.切割產(chǎn)物末端：5'突出末端、3'突出末端、平頭末端.6.最適溫度：大多為37°C,適鹽濃度：高鹽、中鹽、低鹽。8.當(dāng)反應(yīng)條件不適合時，識別和切割序列發(fā)生變化（星號反應(yīng)）。星活性（staractivity）：在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星活性。引起星活性的因素：①高濃度甘油（＞5%）、②酶過量（＞100U/yg）、③低離子強度（＜25mM）④高pH（＞pH8.0）、⑤有機溶劑、⑥用其它二價陽離子代替Mg2+,如Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+。II型限制性核酸內(nèi)切酶的命名具體規(guī)則是：以生物體屬名的第一個大寫字母和種名的前兩個小寫字母構(gòu)成酶的基本名稱，如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將株名的一個字母加在基本名稱之后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則還需用一個大寫字母表示這些非染色體的遺傳因子。酶名稱的最后部分為羅馬數(shù)字，表示在該生物體發(fā)現(xiàn)此酶的先后次序。例子：Eschericha（屬名）coli（種名）R（質(zhì)粒）大腸桿菌R質(zhì)粒一EcoRIEcoRVHaemophilus（屬名）influenzae（種名）d（株名）嗜血流感桿菌d株--HindIIHindIII。羅馬數(shù)字表示同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶。特殊性質(zhì)的II型限制酶：同裂酶，同尾酶同裂酶：又稱異源同序酶或異源同工酶，是指識別位點與切割位點均相同的不同來源的酶識別相同序列，如HindIII-HsuI:A/AGCTT同尾酶:是指識別位點不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列的一類酶，如BglII：A/GATCT；BamHI:G/GATCC。同尾酶的切割產(chǎn)物互為粘性末端，并能連接，但連接后二個酶的識別序列均被破壞。DNA連接酶（T4-DNA連接酶）功能：體外連接DNA片段常用的連接酶：T4DNA連接酶參與連接反應(yīng)的基團：3端羥基和5端磷酸基團，形成磷酸二酯鍵DNA連接酶的基本性質(zhì):修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵、修復(fù)RNA-DNA雜合分子中DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵、連接多個平頭雙鏈DNA分子T4DNA連接酶的活性單位定義：在20ul反應(yīng)體系中于16°C，使HindIII切過的九DNA（300Ug/ml，0.12uM5'末端）在30分鐘內(nèi)連接50%所需的酶量為1個NEB單位。DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）基本性質(zhì)：1.5‘~3‘的DNA聚合酶活性2.5‘~3‘的核酸外切酶活性3.3‘~5‘的核酸外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶I的基本用途：1.切口平移標(biāo)記法2.Nicktranslation3制備32P標(biāo)記的探針。所有的DNA聚合酶中只有此酶有該反應(yīng)。缺口平移標(biāo)記原理見ppt。大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow酶）：大腸桿菌DNA聚合酶丨經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。Klenow酶仍擁有5‘~3‘的DNA聚合酶活性和3‘~5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘f3‘的核酸外切酶活性。Klenow酶的基本用途：1.補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端2.DNA片段的同位素末端標(biāo)記CDNA第二鏈的合成4.雙脫氧末端終止法測定DNA序列。T4-DNA聚合酶基本特性：1.5‘~3‘的DNA聚合酶活性和3‘~5‘的核酸外切酶活性（極強）2.在無dNTP時，可以從任何3‘-OH端外切3.在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導(dǎo)地位基本用途：1?切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3'粘性末端，該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多。2.DNA片段的同位素末端標(biāo)記。依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）基本用途：1.以RNA為模板合成CDNA鏈2.雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈核酸酶單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）；雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）；雙鏈核酸外切酶：入核酸外切酶（入Exo）【特異性地從5‘端外切】單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶【降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍，比降解單鏈RNA快7倍】5．核酸修飾酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）；堿性磷酸單酯酶【小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）&大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）】T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）二、用于克隆的載體載體（Vector）：是把外源DNA（目的基因）導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之傳代、擴增或表達(dá)的工具。載體應(yīng)具備的條件：1.具有針對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）2.具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或結(jié)合位點3.具有較高的外源DNA的載裝能力4.具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點（多克隆位點）5.具有合適的篩選標(biāo)記載體類型：（1）根據(jù)主要用途可以分為：克隆載體和表達(dá)載體克隆載體：主要用于在大腸桿菌細(xì)胞中克隆目的基因，或在大腸桿菌或釀酒酵母細(xì)胞中構(gòu)建基因文庫?？寺≥d體關(guān)鍵元件：A.多克隆位點B.篩選標(biāo)記基因C.復(fù)制起始位點表達(dá)載體：除含基因克隆所需元件外，還有供外源基因表達(dá)用的啟動子、終止子等順式元件，用于在特定的宿主中表達(dá)目的基因。（2）按傳代特性分：自主復(fù)制型載體：含復(fù)制子，可獨立于宿主染色體外復(fù)制與傳代（穿梭載體：裝有針對兩種不同受體的復(fù)制起點，便于基因克?。?。整合型載體：不含復(fù)制子，需借助同源重組機制整合于宿主基因組。分子克隆載體常用類型：（1）質(zhì)粒：15kb以下嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒：1-5拷貝，如pSC101松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒：30-50拷貝，如ColE1氯霉素擴增：在宿主菌生長的中后期，通過添加氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成、關(guān)閉主要代謝途徑，以使松弛型質(zhì)粒迅速大量擴增（可達(dá)上千拷貝）的操作。質(zhì)粒載體的特點：分子量小，便于操作；易于構(gòu)建，可作為其他宿主系統(tǒng)載體的骨架；用途廣泛；缺點：裝載量?。ㄐ∮?0kb）,不能用來克隆大片段。重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體：PBR322：松弛型復(fù)制；氯霉素可擴增；拷貝數(shù)50-100/cell；用于基因克隆。還有pUC1&19；T載體，詳見ppt，了解一下。實驗室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA：①氯化銫密度梯度離心法：質(zhì)粒DNA純度高、周期長、設(shè)備要求高、溴乙錠污染；②堿裂解法（最常用）：質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴法之間；③沸水浴法：質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡便。質(zhì)粒的不相容性的分子機制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，可導(dǎo)致子代細(xì)胞質(zhì)粒組成不同，且這種差異具隨機性，經(jīng)過若干代后宿主細(xì)胞中處于數(shù)量弱勢的質(zhì)粒必然被淘汰，而僅剩強勢質(zhì)粒。質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的類型分離的不穩(wěn)定性：在細(xì)胞分裂過程中發(fā)生的質(zhì)粒不平均的分配，有的細(xì)胞沒有獲得質(zhì)粒DNA拷貝，并最終增殖成為無質(zhì)粒的優(yōu)勢群體。結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性：由轉(zhuǎn)位作用和重組作用所引起的質(zhì)粒DNA的重排與缺失。影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素新陳代謝負(fù)荷對質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)；拷貝數(shù)差度對質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的影響——低差度-穩(wěn)定/高差度-不穩(wěn)定；寄主重組體系對質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)一一形成重組質(zhì)粒二聚體，便會以高出質(zhì)粒單體分子兩倍的速度進行復(fù)制，從而導(dǎo)致出現(xiàn)質(zhì)粒寡聚體的克隆增殖。（2）lamda噬菌體DNA:25kb入噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體，由外殼包裝蛋白和I-DNA組成。DNA重組技術(shù)一般需要入噬菌體進入溶菌狀態(tài)入-DNA是線性雙鏈DNA分子，全長48502個核苷酸。入-DNA兩端各帶有一個12bp的粘性末端，稱為cos位點。噬菌體感染細(xì)菌以后，雙鏈DNA分子通過COS位點成環(huán)狀。插入型載體：改造后的長度正好為包裝的下限，因而本身也能被包裝，叫插入型載體1?cl基因失活：cl基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。2.LacZ基因插入失活：在lacZ基因上有EcoR丨位點，插入失活后利用X-gal法篩選（藍(lán)白篩選）。取代型載體：長度為40kb,在非必需區(qū)域有酶切位點，距離為14kb。載量為10-25kb。用取代型載體克隆外源DNA可能需要經(jīng)過哪些步驟？第一，應(yīng)用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶消化入載體，除去基因組中可取代的DNA區(qū)段。第二，將上述所得的入DNA臂同外源DNA片段連接。第三，對重組體的入DNA分子進行包裝和增殖，以得到有感染性的入重組噬菌體。入-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。入-DNA作為載體的優(yōu)點：1.入-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌2.入-DNA載體的裝載能力為25kb,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量3.重組l-DNA分子的篩選較為方便4.重組入-DNA分子的提取較為簡便5.入-DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達(dá)外源基因。cos質(zhì)粒：lamdaDNA的cos區(qū)和質(zhì)粒組成的載體:31-45kb（3）考斯質(zhì)粒載體的特點：能像入-DNA那樣進行體外包裝,并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞2.能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制3.重組操作簡便，篩選容易4.裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍5.不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞.（4）人工染色體載體人工染色體實際上是一種“穿梭”克隆載體：含有質(zhì)?？寺≥d體所必備的第一受體（大腸桿菌）源質(zhì)粒復(fù)制起始位點（ori）,還含有第二受體（如酵母菌）染色體DNA著絲點、端粒和復(fù)制起始位點的序列，以及合適的選擇標(biāo)記基因。細(xì)菌人工染色體（BAC）:50-300kb,主要用于基因文庫構(gòu)建一一易于發(fā)生重組、缺乏穩(wěn)定性、制備工藝繁瑣酵母人工染色體（YAC）:350-400kb，主要用于基因文庫構(gòu)建——克隆大型基因簇（genecluster）結(jié)構(gòu)&構(gòu)建動植物基因文庫三、用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞（1）受體（宿主）應(yīng)具備的條件1?限制性缺陷型一一外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（hsdR-）2.重組整合缺陷型一一用于基因擴增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞（recA-，recB-,recC-）3.具有較高的轉(zhuǎn)化效率4.具有與載體選擇標(biāo)記互補的表型5.感染寄生缺陷型——防止重組細(xì)菌擴散污染，生物武器除外。（2）各種基因工程受體（宿主）的特性大腸桿菌一一遺傳背景清楚，載體受體系統(tǒng)完備，生長迅速，培養(yǎng)簡單，重組子穩(wěn)定。適用于外源DNA的擴增和克隆、基因文庫的構(gòu)建和外源基因的高效表達(dá)，是DNA重組實驗和基因工程的主要受體菌。產(chǎn)生結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多的內(nèi)毒素?？莶菅挎邨U菌一一遺傳背景清楚，蛋白質(zhì)分泌機制健全，生長迅速，培養(yǎng)簡單，不產(chǎn)內(nèi)毒素。遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備。適用于重組蛋白與多肽、特別是微生物來源的酶的高效分泌表達(dá)。C?鏈霉菌——抗生素的主要生產(chǎn)者，相對操作簡便，不產(chǎn)內(nèi)毒素。遺傳不穩(wěn)定，生長相對緩慢。主要用于抗生素生產(chǎn)菌株的改良。D.酵母菌——具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)簡單，外源基因表達(dá)系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定。內(nèi)源性蛋白產(chǎn)物種類繁多且含量高。適用于外源DNA的擴增、克隆以及真核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫的構(gòu)建、真核生物基因表達(dá)調(diào)控的研究，是DNA重組實驗和基因工程重要的真核性受體菌。昆蟲細(xì)胞（家蠶，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)）——具有真核生物的特征，外源基因表達(dá)量高，繁殖相對較快，培養(yǎng)成本低廉，遺傳穩(wěn)定。DNA重組操作系統(tǒng)欠完善。適用于真核生物基因的高效表達(dá)。哺乳動物細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO）――與人的親緣關(guān)系近，表達(dá)系統(tǒng)完善，具有合適的糖基化修飾系統(tǒng)。細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻，生長緩慢。適用于哺乳類動物和人的基因表達(dá)調(diào)控研究、基因藥物的生產(chǎn)，是DNA重組實驗和基因工程的主要哺乳動物受體。植物細(xì)胞（擬南芥菜、煙葉）——農(nóng)作物的經(jīng)濟意義重大，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞易于分化，細(xì)胞培養(yǎng)簡單且成本低廉，具有光合作用。遺傳操作繁瑣。適用于高等植物基因表達(dá)調(diào)控的研究、基因藥物的生產(chǎn)，農(nóng)作物品質(zhì)的改良。實驗室常用的基因工程受體（宿主）：大腸桿菌；真菌：酵母菌（畢赤酵母，漢森酵母，啤酒酵母）&絲狀真菌（黑曲霉、青霉）；哺乳動物細(xì)胞CHO（3）大腸桿菌轉(zhuǎn)化常用方法感受態(tài)（compentent）:受體（宿主）細(xì)胞經(jīng)過一些理化或生物學(xué)方法處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生暫時性的改變，成為能允許外源DNA進入的一種生理狀態(tài)。感受態(tài)細(xì)胞（compententcell）CaCI2法原理Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA與其形成抗Dnase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時的狀態(tài)即為感受態(tài)。具體大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化詳見ppt。電轉(zhuǎn)化法③熱激法轉(zhuǎn)化率的定義：每微克DNA分子轉(zhuǎn)化宿主菌能獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)。例如，pUC18對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，即每微克pUC18中只有108個分子能進入受體細(xì)胞。一微克pUC18共有3.4X1011個分子（6.02X1017/2686X660）,也就是說，每3400個pUC18分子才有一個分子進入受體細(xì)胞。另一方面，在實際操作過程中，轉(zhuǎn)化一微克pUC18共需2ml感受態(tài)細(xì)胞，大約含有2X1010個大腸桿菌細(xì)胞，也就是說，每200個細(xì)胞只有一個細(xì)胞能接納pUC18DNA。不同轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化率:Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化——106-107/mgDNA原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化——105-106/mgDNA入-DNA轉(zhuǎn)染107-108/mgDNA電穿孔轉(zhuǎn)化106-109/mgDNA轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子。轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定流程1、篩選一選擇性平板篩選一2、重組子初步鑒定一一顯色、PCR、比大小、酶切、分子雜交、生物/免疫學(xué)活性一3、重組子確證一DNA序列分析一4、外源基因表達(dá)產(chǎn)物檢測一一僅當(dāng)外源基因克隆于特定表達(dá)載體和宿主中時才需要。常規(guī)基因克隆則否。轉(zhuǎn)化子篩選方法:抗藥性篩選法；營養(yǎng)缺陷型篩選法；顯色篩選法一一acZ，基因（藍(lán)色反應(yīng)）、鏈霉菌質(zhì)粒plJ702攜帶的melC基因（黑色反應(yīng)）等；DNA電泳檢測【直接電泳檢測法；限制性酶切圖譜法；PCR擴增檢測法】原位雜交法（高通量篩選）；DNA序列分析一一雙脫氧末端終止測序法；外源基因表達(dá)產(chǎn)物檢測法【聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS）；酶聯(lián)免疫吸附法一ELISA；免疫印記（Westernblotting）；蛋白質(zhì)生物功能測定法（高通量篩選）一淀粉酶基因；原位免疫沉淀法（高通量篩選）；放射免疫原位雜交鑒定】四、基因克隆基因文庫：從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：基因組文庫（含有全部基因）&cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）。在高度分化的生物體中cDNA文庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫基因克隆常用方法：鳥槍法基本策略：染色體DNA的切斷：超聲波處理一一片段長度均一，大小可控，平頭末端；全酶切一一片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控；部分酶切——片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整。與載體連接：如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達(dá)型載體。轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞——如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞。篩選含有目的基因的目的重組子：菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立）。cDNA法基本策略：【cDNA第一鏈的合成一cDNA第二鏈的合成（自身引導(dǎo)法、置換合成法、引導(dǎo)合成法、）】/雙鏈cDNA的克隆一離目的基因（完備分離程序、特異分離程序、差異分離程序）PCR法使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物基本策略：由TaqDNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物中，其3'末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是A，因為TaqDNA聚合酶對dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的T載體克隆?；瘜W(xué)合成法（全基因合成）基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N=ln（1-P）/ln（1-f）其中：P=任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕剩琭=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小?；蛭膸斓臉?gòu)建程序基因組DNA的制備：基因組DNA的切割：用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和制性內(nèi)限切酶部分酶切兩種方法，其目的是：第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)；第二，保證DNA片段大小均一。連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體載體和受體的選擇：出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的入-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC或BAC載體。cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒；用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌。從基因文庫中篩選目的基因：可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選法、酵母雙雜交技術(shù)等）直接篩選外，一般的基因組文庫篩選均需多輪操作步驟。原位雜交法。第三章大腸桿菌基因工程一、大腸桿菌表達(dá)（生產(chǎn)）系統(tǒng)的優(yōu)缺點大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點1?遺傳背景清楚（4405個0RF），便于基因操作2?表達(dá)水平高，遺傳較穩(wěn)定3?優(yōu)良的工業(yè)性能：繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便4?被美國FDA認(rèn)定為安全的重組藥物生產(chǎn)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的缺點缺乏翻譯后修飾加工系統(tǒng)（不能表達(dá)糖基化蛋白、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白等）2.胞內(nèi)缺乏高效的表達(dá)產(chǎn)物折疊機制（形成包涵體），分泌機制不完善3.細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素二、大腸桿菌系統(tǒng)高效表達(dá)原理①大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)載體的基本元件A、目的基因：編碼外源蛋白的結(jié)構(gòu)基因B、轉(zhuǎn)錄元件：啟動子、終止子C、翻譯元件：核糖體結(jié)合位點、翻譯起始位點D、克隆元件：克隆位點、復(fù)制原點、標(biāo)記基因E、翻譯后元件（非必須）：信號肽、融合肽②外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)原理啟動子（Promoter）是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始RNA合成的序列。是基因表達(dá)最關(guān)鍵和最強的表達(dá)調(diào)控元件，啟動子的強弱對表達(dá)水平有決定性影響。（沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄）。啟動子有種屬特異性（如真核的在原核宿主中無效），有組成型（組成型表達(dá)系統(tǒng)）和誘導(dǎo)型（誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)）二大類。原核基因啟動子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成：（1）Pribnow盒，位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游5—10bp,—般由6?8個堿基組成，富含A和T,故又稱為TATA盒或一10區(qū)。（2）—35區(qū)，位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游35bp處，故稱一35區(qū)，一般由10個堿基組成。常用原核基因啟動子：【lac俘L糖啟動子）；trp（色氨酸啟動子）；tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動子——Ptac=Ptrp的-35區(qū)+Plac的TO區(qū)）；T7啟動子】——IPTG誘導(dǎo)；PL和PR（入噬菌體的左向和右向啟動子）——溫控（熱誘導(dǎo)），30°C/37°C培養(yǎng)，42°C誘導(dǎo)。T7啟動子一一最成功的啟動子A?強大的T7啟動子完全專一受控于T7RNA聚合酶，T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶的快5倍由于大腸桿菌本身不含T7rna聚合酶，需要將外源的T7rna聚合酶引入宿主菌（采用DE3溶源菌，T7RNA聚合酶置于LacUV5啟動子控制下，IPTG間接誘導(dǎo)）。B、終止子轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象：A.RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的B.DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物。防止轉(zhuǎn)錄過頭策略：A、采用強終止子——大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2T7&噬菌體DNA上的T①B、二聚體終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)C、核糖體結(jié)合位點（RBS）mRNA5'端非翻譯序列，包括SD、起始密碼子、SD與起始密碼子間的序列、起始密碼子下游序列。SD序列（Shine-Dalgarno）:位于翻譯起始密碼子上游的6-8個核苷酸序列（5‘UAAGGAGG3'），它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3'端區(qū)域3'AUUCCUCC5'并與之專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯。D、質(zhì)粒拷貝數(shù)策略：較低拷貝質(zhì)粒（幾個至數(shù)十個）&調(diào)控重組質(zhì)粒的擴增E密碼子滿足宿主對密碼子偏愛性的策略:外源基因全合成&同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因三、大腸桿菌工程菌的構(gòu)建策略1、包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體：胞內(nèi)高效表達(dá)時，工程菌因大量合成異源蛋白質(zhì)所形成的水不溶性積聚物。性質(zhì)：致密（密度大于細(xì)胞碎片和所有細(xì)胞器）、還含有標(biāo)記蛋白、RNA聚合酶和少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。裸露或被膜包裹。包涵體形成原因：大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)呈“還原”型環(huán)境，不不利于二硫鍵的形成，當(dāng)高效表達(dá)時，新合成肽形成二硫鍵的速度和折疊效率跟不上合成速度。表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)形式：a）部分屬于折疊過程中的產(chǎn)物；b）部分為無序卷曲與聚集，分子內(nèi)二硫鍵錯配；c）分子間存在大量錯配二硫鍵。以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點：、便于表達(dá)產(chǎn)物分離一一涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來、利于表達(dá)產(chǎn)物在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在一一在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用基本上對異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅包涵體表達(dá)形式的缺點：——以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。然而，這也是一個技術(shù)難題，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)停话悴怀^30%。包涵體的溶解與變性包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵在人工條件下，使包涵體溶解并重新進入復(fù)性途徑中。常采用高濃度變性劑：8M尿素、6MGuC打開各種次級鍵，以DTT等巰基試劑打開二硫鍵。能有效促進包涵體溶解變性的試劑和條件包括：促溶劑最常用,鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng)表面活性劑SDS、正十二醇肌氨酸，廉價，但影響復(fù)性和純化混合溶劑如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強極端pH廉價，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)包涵體的復(fù)性與重折疊：二硫鍵形成（將多肽鏈中被拆開的游離巰基氧化重新形成二硫鍵（關(guān)鍵））；通過次級鍵的形成使蛋白質(zhì)重折疊形成二硫鍵的方式主要有：A化學(xué)氧化法一一需要電子受體，最廉價的電子受體為空氣，二硫鍵形成是隨機的,僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊B二硫鍵交換一一需要還原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG）,二硫鍵形成相對特異，因此適用性較廣，重折疊效果好包涵體復(fù)性操作的方法：緩慢降低變性劑濃度，并盡量減低蛋白濃度。詳見老師ppt。包涵體的復(fù)性與重折疊的主要挑戰(zhàn)是：聚集沉淀2、融合型異源蛋白的表達(dá)以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點①目的蛋白穩(wěn)定性高尤其對分子量較小的多肽效果更佳②目的蛋白易于分離利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白③目的蛋白表達(dá)率高與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件④目的蛋白溶解性好由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性⑤缺點：融合蛋白需要裂解和進一步分離，才能獲目的蛋白。在實際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段用于融合蛋白構(gòu)建的Tag（5種）A、His6易于親和層析、不影響目的蛋白結(jié)構(gòu)、無免疫原性B、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）維持良好空間構(gòu)象C、硫氧化還原蛋白（TrxA）維持良好空間構(gòu)象pTrxFusD、麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）促進分泌E、內(nèi)含肽（Intein）：類似內(nèi)含子的多肽，與目的能蛋白融合表達(dá)，在表達(dá)后可進行自剪接，兼有蛋白酶和蛋白連接酶的特性。4°C、DTT條件下切割。目的蛋白的回收⑴化學(xué)裂解法-溴化氰（CNBC法原理：CNBr與Met的硫醚基反應(yīng)，生成高絲氨酸（HMS）殘基留于上游肽段C端基因操作：在二個多肽基因融合處設(shè)置Met的密碼子⑵酶促裂解法原理：利用蛋白酶的專一性識別殘基與位點切開融合肽基因操作：在二個多肽基因融合處設(shè)置蛋白酶識別殘基的密碼子常用多殘基識別位點蛋白酶Thrombin（凝血酶）Leu-Val-Pro-Arg▼Gly-SerEnterokinase（腸激酶）Asp-Asp-Asp-Asp-Lys▼FactorXa（X因子）Ile-Glu/Asp-Gly-Arg^PreScission（5°C切割！GE）Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln^Gly-ProTEVprotease（Invitrogen）Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln^GlyIntein（內(nèi)含肽，自切割，NEB）dithiothreitolcleavage!3、分泌型異源蛋白的表達(dá)蛋白質(zhì)的分泌機制A、在信號肽牽引下跨膜，進入周質(zhì)腔；B、信號肽酶切下信號肽，釋放目的蛋白于周質(zhì)腔。以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點A、分泌表達(dá)形式的優(yōu)點：①目的蛋白以呈正確折疊的可溶形式存在（周質(zhì)為氧化型環(huán)境，利于二硫鍵形成）②目的蛋白穩(wěn)定性咼（周質(zhì)腔蛋白酶少）③目的蛋白末端完整相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白N端并不含有的甲硫氨酸殘基便可在信號肽的剪切過程中被有效除去B分泌表達(dá)形式的缺點：相對其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因即便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)水平通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍。主要用于實驗室小規(guī)模制備。4、寡聚型異源蛋白的表達(dá)以寡聚形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點①穩(wěn)定表達(dá)小分子短肽——短肽由于缺乏有效的空間結(jié)構(gòu)，易受蛋白酶攻擊，易降解，串聯(lián)短肽具有與蛋白質(zhì)相似的長度及空間結(jié)構(gòu)，可抗蛋白酶降解。②目的蛋白高效表達(dá)一一在不提高質(zhì)?？截悢?shù)的前提下，增加目的基因的拷貝數(shù)③目的產(chǎn)物回收困難四、工程菌構(gòu)建、分析、發(fā)酵與產(chǎn)物分離純化（1）工程菌構(gòu)建與分析（2）工程菌遺傳穩(wěn)定性分析在非選擇條件下連續(xù)傳代數(shù)代后，對工程菌重組質(zhì)粒存在狀況、結(jié)構(gòu)完整性和功能完整性進行一下三項分析：A、存在狀況：宏觀逃逸率B、結(jié)構(gòu)完整性：酶切圖譜分析、序列分析C、功能完整性：表達(dá)水平工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式分配不穩(wěn)定性（主要）：整個重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸（curing）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性：重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失重組質(zhì)粒的逃逸：工程菌部分細(xì)胞因質(zhì)粒丟失而不再攜帶重組質(zhì)粒的現(xiàn)象。重組質(zhì)粒逃逸的原因目的基因本底表達(dá)產(chǎn)物引起的毒性反應(yīng)——關(guān)閉質(zhì)粒DNA合成途徑，啟動降解程序目的基因高效表達(dá)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)③抗性標(biāo)記基因過表達(dá)，抗生素消耗過快。④目的基因表達(dá)盒“轉(zhuǎn)錄過頭”，影響Ori區(qū)域。⑤☆環(huán)境因素誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒滲漏一一高溫、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料（吖啶）重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率：工程菌培養(yǎng)液中丟失質(zhì)粒的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比?！锖暧^逃逸率（％）=（非選擇性平板菌落數(shù)一選擇性平板菌落數(shù)）/非選擇性平板菌落數(shù)X100（3）發(fā)酵工藝研究工程菌生長與表達(dá)主要影響因素1、培養(yǎng)基：影響菌體生長、質(zhì)粒穩(wěn)定性、表達(dá)水平、產(chǎn)物可溶性等碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等應(yīng)避免外源基因表達(dá)的“葡萄糖效應(yīng)”。氮源：有機氮：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿無機氮：氨水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等其他：無機鹽、微量元素維生素、生物素等2、菌齡與接種量菌齡：自接種起培養(yǎng)的時間（小時）影響停滯期、質(zhì)粒宏觀逃逸率接種量：是指接入的種子液體積占培養(yǎng)液體積的百分比過小：延長菌體停滯期，質(zhì)粒宏觀逃逸率高過大：菌體生長過快，代謝產(chǎn)物積累過多，抑制后期菌體的生長，降低表達(dá)水平。3、pH值、溫度與溶解氧pH值：影響生長速度、表達(dá)水平和產(chǎn)物可溶性。生長最適pH范圍在，表達(dá)最適pH為溫度：影響生長速度、表達(dá)水平和產(chǎn)物可溶性。生長最適37°C，較低溫度利于可溶表達(dá)。溶解氧：影響生長速度和表達(dá)水平4、誘導(dǎo)時機與收菌時機誘導(dǎo)時機：過早影響生物量、過晚影響表達(dá)水平。一般在生長曲線對數(shù)中期或?qū)?shù)后期進行誘導(dǎo)收菌時機：過早影響表達(dá)水平、過晚影響產(chǎn)物穩(wěn)定性、可溶性、并造成浪費。一般在表達(dá)曲線平臺期（誘導(dǎo)后3-4小時）收菌工程菌搖瓶水平生長與表達(dá)試驗主要研究參數(shù)：培養(yǎng)基、接種量、pH值、溫度、誘導(dǎo)與收菌時機等主要觀察指標(biāo)：表達(dá)水平（%）、生物量、表達(dá)產(chǎn)物積累（包涵體形成）情況、質(zhì)粒宏觀逃逸率等結(jié)果：生長曲線與表達(dá)曲線（4）工程菌工業(yè)發(fā)酵工藝研究工程菌發(fā)酵工藝基本要求與重點問題：基本要求：高表達(dá)、高生物量、便于放大、低成本重點問題：1）質(zhì)粒穩(wěn)定性問題2）表達(dá)與生長的矛盾問題（誘導(dǎo)時機）3）發(fā)酵方式問題：分批式or流加式發(fā)酵？常規(guī)發(fā)酵or高密度發(fā)酵？發(fā)酵方式：1）批式發(fā)酵：較常用，高表達(dá)、但菌體量較少。2）流加發(fā)酵：較常用，主要補充碳源，菌體量大、表達(dá)水平下降，碳源流加時機和速度是關(guān)鍵。☆高密度發(fā)酵：無機鹽介質(zhì)，通過碳源限制和流加實現(xiàn)高密度發(fā)酵。3）連續(xù)發(fā)酵：少用，高表達(dá)、高總生物量、難控制。工程菌工業(yè)發(fā)酵工藝流程（如圖所示）：（5）表達(dá)產(chǎn)物分離純化工藝研究表達(dá)產(chǎn)物分離純化原則：1）要建立一個方便靈敏的蛋白檢測方法，以估價每一步的提純程度；2）分離步驟要盡可能少，每一步便于工業(yè)放大；3）盡量采用柱層析技術(shù)，各步驟間樣品應(yīng)無需復(fù)雜處理；4）初步分離要快速、大規(guī)模，精純要高分辨率；5）盡可能避免帶入有害物質(zhì);6）每步需統(tǒng)計：得率、純度、純化倍數(shù)分離提純有三步策略：粗提、中度純化、精細(xì)純化以下是粗提的圖示第四章非腸道原核細(xì)菌基因工程芽孢桿菌基因工程1、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)、缺點優(yōu)點：1、強大的分泌功能：如蛋白酶、淀粉酶，20g/L2、不形成包涵體，產(chǎn)物可正確折疊3、非病原菌，無內(nèi)毒素和外毒素，被美國FDA認(rèn)定為GRAS（總體安全）系統(tǒng)4、容易操作，背景清楚5、易于培養(yǎng)、生長旺盛缺點：同源蛋白表達(dá)高（g/L）、異源蛋白低（mg/L）2、大腸桿菌與芽胞桿菌在表達(dá)外源基因方面的比較腸桿菌芽胞桿菌模式生物是否革蘭氏染色G-G+表達(dá)產(chǎn)物的分泌功能極少大多數(shù)包涵體形成不形成表達(dá)水平高對同源蛋白高，異源蛋白較低生物安全性高高分離純化過程復(fù)雜：復(fù)性、去內(nèi)毒素簡單糖基化修飾無無3、高效表達(dá)原理1）異源啟動子：大腸桿菌系統(tǒng)的啟動子結(jié)構(gòu)與芽孢桿菌的高度相似，異源啟動子有效2）短小芽抱桿菌胞壁蛋白操縱子調(diào)控元件：中壁蛋白（MWP）和外壁蛋白基因組成一個操縱子（cwp）,由啟動子、SD序列和分泌信號肽序列組成的5'端（0.6kb）序列可用于外源基因分泌表達(dá)。調(diào)控機制：完整的胞壁阻遏轉(zhuǎn)錄,生長平臺期胞壁蛋白的脫落和介質(zhì)中的低濃度的Mg++誘導(dǎo)（去阻遏）。3）利用枯草芽抱桿菌胞外果聚糖酶操縱子調(diào)控元件果聚糖酶操縱子（sacB）由啟動子PsacB、上游正調(diào)控序列DegQ和SacU、果聚糖酶基因（sacX）、下游終止子樣序列和抗終止蛋白SacY基因組成。第五章真菌基因工程一、真菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點具有原核系統(tǒng)的操作簡便、分子生物學(xué)背景清楚的優(yōu)點,具有真核系統(tǒng)蛋白翻譯后加工和分泌系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，為GARS系統(tǒng)缺點：產(chǎn)物糖基化位點和結(jié)構(gòu)特點與高等真核的有差距二、釀酒酵母載體系統(tǒng)1、野生型質(zhì)粒：2□質(zhì)粒（釀酒酵母）2、人工構(gòu)建質(zhì)粒:5種酵母附加型質(zhì)粒（YEp）酵母復(fù)制型質(zhì)粒（YRp）酵母著絲粒質(zhì)粒（YCp）酵母人工染色體（YAC）酵母整合型質(zhì)粒（YIp）3、標(biāo)記：營養(yǎng)缺陷型的互補基因/抗性基因宿主細(xì)胞：為氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突變子，主要有：LEU-、TRP-、HIS-、URA-載體：攜帶相應(yīng)的合成基因，如：Ieu1/leu2、trpl、his3/his4、ura3選擇壓力：不完全培養(yǎng)基，如：YNB、無機鹽培養(yǎng)基4、酵母菌轉(zhuǎn)化方法A、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法：細(xì)胞：去壁的原生質(zhì)體原理：以PEG等滲緩沖液穩(wěn)定原生質(zhì)體，以Ca2+誘導(dǎo)細(xì)胞攝取外源DNA。特點：30%以上為多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化效率：可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%，但操作周期長，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴(yán)重制約。B、堿金屬離子介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法：細(xì)胞：帶壁的完整細(xì)胞原理：通過堿金屬離子（如Li+等）、PEG和熱休克處理誘導(dǎo)細(xì)胞吸收外源DNA。特點：方法簡便，容易掌握，實用性強；吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍；共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極為罕見。C、電激轉(zhuǎn)化法：細(xì)胞：帶壁完整細(xì)胞或原生質(zhì)體原理：通過電脈沖對細(xì)胞膜造成DNA攝取通道特點：轉(zhuǎn)化率高（105/mgDNA）、操作簡便、適用范圍廣5、用作外源基因表達(dá)的酵母宿主菌釀酒酵母：最成熟的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)水平低，產(chǎn)物過度糖基化甲醇酵母：可以利用甲醇作唯一碳源，表達(dá)水平高，產(chǎn)物糖基化更合理畢赤酵母：巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）漢遜酵母：多型漢遜酵母（Hansenulapolymorpha）其它酵母：已有60多種酵母菌建立了轉(zhuǎn)化系統(tǒng)乳酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis）非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）6、釀酒酵母糖基化系統(tǒng)糖基化位點：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）N-型糖基化：天門冬酰氨酸殘基上的酰胺氮進行糖基化，對蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性及活性較重要。O-型糖基化：蘇氨酸/絲氨酸上的羥基氧進行糖基化三、甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子：指可利用甲醇作單一碳源的一類酵母，如：畢赤酵母、漢森酵母、假絲酵母甲醇氧化酶啟動子：A、目前已發(fā)現(xiàn)的、最強的真核啟B、嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控型啟動子：AOX1:甲醇誘導(dǎo)，葡萄糖阻遏，甘油脫阻遏MOX：甲醇誘導(dǎo)，葡萄糖阻遏、甘油脫阻遏2、甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點A、表達(dá)水平高（最高水平的系統(tǒng)）B、產(chǎn)物可翻譯后修飾：糖基化、磷酸化、酰脂化C、過糖基化程度比釀酒酵母少（8-15個VS100-150個甘露糖）D、產(chǎn)物可正確折疊和咼效分泌（最咼分泌表達(dá)系統(tǒng)）E、可利用簡單無機鹽培養(yǎng)基高密度發(fā)酵，生物量大。F、實驗室和工業(yè)操作簡單G、不能滿足結(jié)構(gòu)要求嚴(yán)格的糖基化3、甲醇酵母二大宿主系統(tǒng)主要特點項目畢赤酵母漢遜酵母最適溫度30°C37°C最適pH值4.54.5甘油阻遏是否糖基化部分過度較正常高密度發(fā)酵100g/L100g/L選擇標(biāo)記his4、G418、Zeocin、Cu++leu2、his3、ura3、G4184、畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)載體與整合模式5、多拷貝整合重組子篩選必要性：目的基因表達(dá)盒的多拷貝整合是高效表達(dá)的基礎(chǔ)，但多拷貝整合是低概率事件（1-10%）G418抗性篩選：表達(dá)載體引入卡拉霉素基因（Kanamycin）作二級篩選標(biāo)記，從His4+轉(zhuǎn)化子中篩選高G418抗性轉(zhuǎn)化子，抗性越高整合拷貝數(shù)越高。雜交篩選：菌落原位或Dot-Blotting雜交篩選6、His+轉(zhuǎn)化子甲醇表型篩選必要性：A、不同目的基因的表達(dá)偏愛不同甲醇表型B、工程菌表達(dá)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化需要依據(jù)甲醇表型C、限切酶線性化方式誘導(dǎo)靶向整合（下表），但即使非AOX1取代型整合方式，也有可能因同源重組而破壞AOX1基因，產(chǎn)生MutS表型。線性化位點整合事件GS115株KM71株（限切位點）（位點）（AOX1野生）（AOX1缺失）SalIorStuI插入，his4His+Mut+His+MutsSacI插入，5'AOX1His+Mut+His+MutsNotIorBglII取代，AOX1His+MutsHis+Mut+Arg-7、轉(zhuǎn)化子PCR鑒定必要性：證明外源基因確實整合在宿主基因組DNA,并排除意外丟失目的基因（機理不明）的His+表型轉(zhuǎn)化子。PCR鑒定：以GS115的His+轉(zhuǎn)化子為例模板：轉(zhuǎn)化子基因組DNA引物：Primer5'來自5'A0X1；Primer3'：TT（3'A0X1）產(chǎn)物：a.目的基因（AOX1缺失，Muts型轉(zhuǎn)化子）b.目的基因+完整AOX1基因（Mut+型轉(zhuǎn)化子）高密度發(fā)酵工藝流程與碳源操作種子液制BMGY,至對數(shù)期，16-24hr,OD600=2-6基礎(chǔ)培養(yǎng)4%甘油+無機鹽培養(yǎng)基，至甘油耗盡，18-24hr甘油流加以50%甘油限制性流加，增加細(xì)胞密度，4hr，180-220g/L甲醇流加期以100%甲醇限制性流加，誘導(dǎo)表達(dá)，增加細(xì)胞密度，48-68hr，350-450g/LV收罐（固液分離）第六章昆蟲基因工程1、DNA轉(zhuǎn)座子的類型插入序列（IS）：最簡單的轉(zhuǎn)座子稱為插入序列（Insertionsequence，IS）。IS家族有很多成員，它們的結(jié)構(gòu)相似特征：兩端都有短5-9bp的正向重復(fù)序列（directrepeats,DR）（靶序列），略長15-25bp的反向重復(fù)序列（invertedrepeats,IR）1kb左右的編碼區(qū)，它僅編碼和轉(zhuǎn)座有關(guān)的轉(zhuǎn)座酶。復(fù)合轉(zhuǎn)座子（compositetransposon）復(fù)合轉(zhuǎn)座子是由兩個重復(fù)序列夾著一個或多個結(jié)構(gòu)基因如某些抗藥性基因和其它基因組成。存在于R因子及其它質(zhì)粒中。復(fù)合轉(zhuǎn)座子兩端的組件由IS和類IS組成。2、DNA轉(zhuǎn)座的一般模式轉(zhuǎn)座可被分為復(fù)制性和非復(fù)制性兩大類。在復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，所移動和轉(zhuǎn)位的是原轉(zhuǎn)座子的拷貝。轉(zhuǎn)座酶（transposase）和解離酶（resolvase）分別作用于原始轉(zhuǎn)座子和復(fù)制轉(zhuǎn)座子°TnA類轉(zhuǎn)座主要是這種形式。在非復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，原始轉(zhuǎn)座子作為一個可移動的實體直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以這種方式進行轉(zhuǎn)座。3、果蠅轉(zhuǎn)座元件Copia反轉(zhuǎn)座子；FB家族；元件P因子P因子全長2907bp，兩端有31bp的反向重復(fù)序列。4個編碼區(qū)、3個內(nèi)含子。

體細(xì)胞中，只有內(nèi)含子1、2被順利切除，產(chǎn)生前3個外顯子的功能型mRNA，被翻譯成66KD的轉(zhuǎn)座阻遏蛋白——一種轉(zhuǎn)座活性的抑制因子。生殖細(xì)胞中，內(nèi)含子3被切除，產(chǎn)生的成熟mRNA包括全部4個外顯子并被翻譯成87KD的轉(zhuǎn)座酶，才能導(dǎo)致P因子轉(zhuǎn)座和配子不育。P元件介導(dǎo)的果蠅雜交不育的原因：P元件在染色體s遺傳位點的插入往往會導(dǎo)致不育，這是由于很多的P因子發(fā)生轉(zhuǎn)座，造成插入突變。含有P因子的雌果蠅與無論是否帶有P因子的雄果蠅雜交，由于P細(xì)胞型的存在抑制了轉(zhuǎn)座酶的合成或激活，表現(xiàn)出正常的生育能九但當(dāng)雌果蠅為M型時，在卵中無阻遏物，這樣導(dǎo)致了來自雄果蠅生殖細(xì)胞中的P因子轉(zhuǎn)錄為轉(zhuǎn)座酶。4、桿狀病毒1）桿狀病毒科分為包涵體桿狀病毒和非包涵體桿狀病毒2）宿主僅限于無脊椎動物3）桿狀病毒的基因組為單一閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子4）桿狀病毒基因組可在昆蟲細(xì)胞核復(fù)制和轉(zhuǎn)錄5）雙相生活史第一時相：時間：感染后的0-24小時。結(jié)果：產(chǎn)生大量的BV，出芽釋放，在蟲體內(nèi)傳播第二時相：時間：感染24小時以后。結(jié)果：形成大量的0DV,被多角體蛋白包裹，最終形成多角體，經(jīng)口感染其它宿主。5、桿狀病毒高效表達(dá)系統(tǒng)1）病毒基因組較大，可以插入相當(dāng)大的外源DNA片段2）常采用多角體蛋白基因啟動子（polh-P）3）常采取轉(zhuǎn)移載體與野生病毒體內(nèi)重組方式構(gòu)建重組病毒4）重組病毒多角體蛋白基因的編碼區(qū)被外源基因取代，喪失形成包涵體功能5）可以家蠶或昆蟲細(xì)胞作表達(dá)宿主優(yōu)缺點：表達(dá)產(chǎn)物的修飾加工系統(tǒng)接近于哺乳動物，表達(dá)水平高，但生產(chǎn)成本高。桿狀病毒表達(dá)外源基因流程亞克隆目的基因分離重組病毒用于基因C亞克隆目的基因分離重組病毒用于基因C>V從大腸桿菌中分離重組桿粒，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞第七章高等動物基因工程高等動物基因工程高等動物基因工程技術(shù)高等動物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)轉(zhuǎn)基因動物個體動物工程動物工程細(xì)胞高等動物基因工程技術(shù)高等動物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)轉(zhuǎn)基因動物個體動物工程動物工程細(xì)胞蛋白多肽物質(zhì)蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)哺乳動哺乳動物遺傳性狀改良生蛋白多肽物質(zhì)蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)物反應(yīng)器大量生產(chǎn)有價值的蛋白1、基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的方法物理方法：裸DNA直接注射、電穿孔、顯微注射化學(xué)方法：磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖法、陽離子脂質(zhì)體法、陽離子-質(zhì)粒復(fù)合物法生物學(xué)方法動物病毒載體：腺病毒、SV40、腺相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、人牛痘病毒、皰疹病毒等。2、人腺病毒DNA載體1）雙鏈環(huán)狀DNA病毒2）腺病毒感染人體細(xì)胞是裂解型，不致癌3）腺病毒可感染處于分裂期或非分裂期的細(xì)胞4）不整合入基因組缺點：免疫原性強、不能持久表達(dá)外源蛋白SV40DNA載體（雙鏈環(huán)狀DNA）基因表達(dá)好外源基因能高效表達(dá)基因重排高病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺失現(xiàn)象宿主范圍窄只能轉(zhuǎn)染猴細(xì)胞裝載量較小反轉(zhuǎn)錄病毒（單鏈RNA病毒）優(yōu)點：A、宿主范圍廣（幾乎所有類型哺乳動物細(xì)胞）B、效率高，可以感染大量的細(xì)胞，通常一次可以感染106?107細(xì)胞C、外源DNA在整合時不發(fā)生重排，單位點、低拷貝整合（一般不超過5個）缺點：A、只感染分裂細(xì)胞B、攜帶外源基因的長度有限（8kb）C、載體病毒基因有潛在的致病性，如存在載體與人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV）序列間發(fā)生D、重組而產(chǎn)生有感染能力的人逆轉(zhuǎn)錄病毒的潛在危險3、動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因動物：是指用實驗導(dǎo)入的方法將外源基因在染色體基因內(nèi)穩(wěn)定整合并能穩(wěn)定表達(dá)和遺傳的一類動物（包括基因敲除的動物）。轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)：是指借助基因工程技術(shù)將體外重組的結(jié)構(gòu)基因?qū)胧芫鸦蛟缙谂咛?，培育出轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)。轉(zhuǎn)基因動物的制作方法一、受精卵雄原核顯微注射法二、胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）法：所得到的動物為嵌合體動物三、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法四、體細(xì)胞核移植法五、精子載