基因工程lectureDNAcloning剖析第1頁/共34頁25.1StrategyandprotocolsforDNACloning第2頁/共34頁3基因克隆基因克隆又稱DNA克隆，其中的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)是重組DNA技術(shù)。重組DNA是用酶學(xué)方法，將不同來源的DNA分子在體外進(jìn)行特異切割、重新連接，組裝成一個新的雜合DNA分子。在此基礎(chǔ)上，這個雜合分子能夠在一定的宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代分子，此過程稱基因克隆。第3頁/共34頁4基因克隆的技術(shù)路線①分離制備待克隆的外源DNA片段②將靶DNA片段與載體連接，組裝成重組DNA分子(recombinantDNA)③重組DNA分子轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞④篩選重組子⑤重組子的擴(kuò)增和目的基因的分析第4頁/共34頁55.2目的基因的來源1.構(gòu)建genomelibrary，從中獲得特定基因2.從mRNA構(gòu)建cDNAlibrary,富集了所需基因3.人工合成DNA片段4.PCR擴(kuò)增特定基因片段第5頁/共34頁6把DNA分子切割或連接成易于與載體連接的片段。單酶切和多酶切；完全酶切和部分酶切；DNA片段的回收。

5.3DNA分子的片段化第6頁/共34頁7PartialrestrictiondigestionEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRICompletedigestionHighenzymeconcentrationIncompletedigestionLowenzymeconcentration第7頁/共34頁8微型凝膠電泳DEAE纖維素膜吸附法低融點(diǎn)凝膠法離心柱層析凝膠DNA片段回收技術(shù)

第8頁/共34頁95.4.1

外源DNA片段與載體DNA片段的三種連接方式5.4DNA片段的體外重組第9頁/共34頁105.4.2同源粘性末端間的連接同尾酶連接時的“焊死”現(xiàn)象。第10頁/共34頁115.4.2同源粘性末端間的連接粘端連接需要避免的2個情況：自身環(huán)化和兩向連接。解決辦法：定向克隆和酶切分析第11頁/共34頁12同一種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接第12頁/共34頁13第13頁/共34頁14第14頁/共34頁155.4.3平端連接平頭末段連接的特點(diǎn)平頭末端連接的問題第15頁/共34頁165.4.4定向克隆的技術(shù)路線

質(zhì)粒載體用BamHI和HindIII消化-〉產(chǎn)生BamHI和HindⅢ的粘性末端-〉與BamHI和HindIII所切出末端相匹配的外源DNA片段相連接外源基因只能以一個方向連接于載體中：外源DNA片段的兩端位點(diǎn)不同，線性DNA(載體或外源DNA片段)的兩個非互補(bǔ)粘端自身環(huán)化的幾率顯然會大大降低。第16頁/共34頁175.4.5DNA末端的修飾改造1.粘性末端修飾成平頭末端后連接第17頁/共34頁185.4.5DNA末端的修飾改造2.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。第18頁/共34頁19第19頁/共34頁203.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。人工合成的、含有限制性內(nèi)切酶識別序列的、短的雙鏈DNA片段。4.DNA插口技術(shù)(adaptor)：人工合成的、具有粘性末端寡聚核苷酸。5.4.5DNA末端的修飾改造第20頁/共34頁21人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ第21頁/共34頁22●

受體細(xì)胞(receptorcell)

又稱為宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞(hostcell)等，從實(shí)驗(yàn)技術(shù)上講是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞;從實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價值和理論研究價值的細(xì)胞?！窀惺軕B(tài)(competence)

細(xì)胞處于能夠吸收DNA的狀態(tài)，稱為感受態(tài)?！窀惺軕B(tài)細(xì)胞(competencecell)

處于能夠吸收DNA狀態(tài)的細(xì)胞。5.5重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞第22頁/共34頁23選擇受體細(xì)胞的基本原則①便于重組DNA分子的導(dǎo)入。②便于重組體的篩選。根據(jù)所用的表達(dá)載體所含的選擇性標(biāo)記與受體細(xì)胞基因是否相匹配，從而易于對重組體進(jìn)行篩選。③遺傳穩(wěn)定性高，易于進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)或易于進(jìn)行高密度發(fā)酵而不影響外源基因的表達(dá)效率。對動物細(xì)胞而言，所選用的受體細(xì)胞具有對培養(yǎng)的適應(yīng)性強(qiáng)，可以進(jìn)行貼壁或懸浮培養(yǎng)，可以在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

第23頁/共34頁24④受體細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)積累，可促進(jìn)外源基因高效分泌表達(dá)。⑤安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染。一般選用致病缺陷型的細(xì)胞或營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞作為受體細(xì)胞。第24頁/共34頁25⑥能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。從受體細(xì)胞的角度出發(fā)，通常的做法是是對其作適當(dāng)?shù)男揎椄脑欤邕x用某些限制性核酸內(nèi)切酶缺陷型的受體細(xì)胞就可以避免其對重組DNA分子的降解破壞作用。第25頁/共34頁26●轉(zhuǎn)化(transformation):指將質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌中的過程?！褶D(zhuǎn)染(transfection):指病毒及其重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程.●轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):指噬菌體及其重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程第26頁/共34頁275.5重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（1）轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化(transformation)指質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。在體外連接組裝而成的DNA重組分子只能轉(zhuǎn)入合適的受體細(xì)胞，才能大量地進(jìn)行復(fù)制、增殖和表達(dá)。其轉(zhuǎn)入方式隨載體的不同而不同。化學(xué)法電擊法第27頁/共34頁28化學(xué)法轉(zhuǎn)化（CaCl2法）

于1972年由Cohen等人首創(chuàng)?；驹恚孩俑惺軕B(tài)制備：使細(xì)菌處于0℃、二價陽離子(如Ca2+、Mg2+等)低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，處于感受態(tài)；②轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面③經(jīng)42℃短時間熱沖擊，細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物④在豐富培養(yǎng)基中生長數(shù)小時后，球狀細(xì)胞復(fù)原并增殖該方法的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)105一106個轉(zhuǎn)化子／ugDNA。可廣泛應(yīng)用于常規(guī)的基因克隆。第28頁/共34頁29第29頁/共34頁30電擊法轉(zhuǎn)化(electroporation)也稱電穿孔法，該法最初用于將DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞，自1988年起就被Dower等人用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。基本原理：利用高壓脈沖，在宿主細(xì)胞表面形成暫時性的微孔，質(zhì)粒DNA乘隙而入，在脈沖過后，微孔復(fù)原，在豐富培養(yǎng)基中生長數(shù)小時后，細(xì)胞增殖，質(zhì)粒復(fù)制。特點(diǎn)：操作簡單，不需制備感受態(tài)細(xì)胞，適用于任何菌株。其轉(zhuǎn)化效率極高(一般可達(dá)109-1010個轉(zhuǎn)化子/ugDNA)，所以常用于文庫的構(gòu)建及其他要求極高的轉(zhuǎn)化。第30頁/共34頁31

電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場強(qiáng)度、電脈沖時間和外源DNA濃度等參數(shù)的影響，通過優(yōu)化這些參數(shù)，每μgDNA可以得到109～1010轉(zhuǎn)化子。電壓增高或電脈沖時間延長時，轉(zhuǎn)化效率將會有所提高，但同時導(dǎo)致受體細(xì)胞存活率的降低，轉(zhuǎn)化效率的提高也因此被抵消。研究表明，當(dāng)電場強(qiáng)度和脈沖時間的組合方式導(dǎo)致50%～70%細(xì)菌死亡時，轉(zhuǎn)化水平達(dá)到最高。第31頁/共34頁32第32頁/共34頁33（2）

轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染(transfection)指噬菌體、病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過程?；驹恚孩僦亟M：外源DNA片段與噬菌體DNA