天津大學生物化學蛋白質化學第1頁/共256頁第四章

蛋白質化學第一節(jié)

蛋白質的分子組成第二節(jié)蛋白質分子的結構第三節(jié)蛋白質的理化性質第四節(jié)氨基酸、蛋白質的分離與鑒定第2頁/共256頁蛋白質化學1(分類）

蛋白質功能

形狀球蛋白：球形、易溶解。組成溶解性

纖維蛋白：形似纖維、不溶于水。單純蛋白：只有α－氨基酸，多數(shù)蛋白。清蛋白（白蛋白）：溶于水。球蛋白：微溶于水，溶于稀鹽。醇蛋白：不溶于水，溶于乙醇。綴合蛋白：與非蛋白質物質結合，如核、糖、脂蛋白。活性蛋白：如酶、激素，受體、膜蛋白。非活性蛋白：膠原蛋白、角蛋白、彈性蛋白。第3頁/共256頁一、蛋白質的元素組成二、組成蛋白質分子的基本單位—氨基酸三、肽鍵與肽第一節(jié)蛋白質的分子組成第4頁/共256頁多數(shù)蛋白質含:

碳(C)50～56%氫(H)6～8%

氧(O)19～24%氮(N)13～19%

硫(S)0～4%有些蛋白質含有磷少數(shù)含鐵、銅、錳、鋅、鈷、鉬等個別還含有碘一、蛋白質的元素組成1第5頁/共256頁凱氏(Kjedahl)定氮法一、蛋白質的元素組成2

每克樣品含氮的克數(shù)×6.25×100=100克樣品中蛋白質的含量(克%)第6頁/共256頁（一）蛋白質的水解（二）氨基酸的分類（三）不常見的氨基酸（四）氨基酸的一般理化性質二、氨基酸（五）氨基酸的化學反應第7頁/共256頁1．酸水解2．堿水解3．酶水解（一）蛋白質的水解第8頁/共256頁（一）蛋白質的水解1（酸水解）

常用方法：硫酸或鹽酸處理濃度:鹽酸為6mol/L

硫酸為4mol/L

條件:回流煮沸20小時左右優(yōu)點:不引起消旋作用，得到L-氨基酸缺點:色氨酸完全被沸酸所破壞羥基氨基酸（絲,蘇）部分被水解天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下來。第9頁/共256頁（一）蛋白質的水解1（堿水解）常用方法：用氫氧化鈉處理濃度:5mol/L條件:共煮10~20h優(yōu)點:色氨酸穩(wěn)定缺點:多數(shù)氨基酸遭到不同程度的破壞，并且產生消旋現(xiàn)象；所得為D型和

L型混合氨基酸；堿水解引起精氨酸脫氨，生成鳥氨酸和尿素。第10頁/共256頁（一）蛋白質的水解1（酶水解1）優(yōu)點:不產生消旋作用，也不破壞氨基酸。缺點:需要幾種酶協(xié)同作用，酶水解所需時間較長。

第11頁/共256頁（一）蛋白質的水解1（酶水解2）（牛胰蛋白酶）胰蛋白酶1第12頁/共256頁（一）蛋白質的水解1（酶水解2）NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點R1：賴氨酸（Lys）精氨酸（Arg）特點：專一性較強，水解速度快胰蛋白酶2第13頁/共256頁（一）蛋白質的水解1（酶水解3）糜蛋白酶1第14頁/共256頁（一）蛋白質的水解1（酶水解3）糜蛋白酶2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點R1：苯丙氨酸(Phe)色氨酸（Trp）蘇氨酸(Thr)亮氨酸(Leu)特點：水解稍慢第15頁/共256頁（一）蛋白質的水解1（酶水解4）胃蛋白酶1第16頁/共256頁（一）蛋白質的水解1（酶水解4）胃蛋白酶2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點R1、R2：苯丙氨酸(Phe)色氨酸（Trp）蘇氨酸(Thr)亮氨酸(Leu)特點：水解速度較快第17頁/共256頁

氨基酸是含有氨基的酸CHRCOO－H3N+第18頁/共256頁(甘油醛的D型、L型)D-甘油醛L-甘油醛透視式投影式第19頁/共256頁氨基酸的構型L－氨基酸D－氨基酸第20頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（三種分類法）1．根據(jù)其化學結構分為：

（1）脂肪族氨基酸（2）芳香族氨基酸（3）雜環(huán)氨基酸2．根據(jù)酸堿性質

（1）酸性氨基酸（2）堿性氨基酸（3）中性氨基酸3．根據(jù)R基團的極性

（1）非極性R基氨基酸（2）極性R基氨基酸（不帶電荷的、帶正電荷的、帶負電荷的）第21頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構1）脂肪族氨基酸1一氨基一羧基氨基酸1普通名稱化學名英文名代號代號甘氨酸氨基乙酸GlycineGly(G)甘第22頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構1）脂肪族氨基酸2一氨基一羧基氨基酸2普通名稱化學名英文名代號代號丙氨酸-氨基丙酸AlanineAla(A)丙第23頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構1）脂肪族氨基酸3一氨基一羧基氨基酸3普通名稱化學名英文名代號代號纈氨酸-氨基異戊酸ValineVal(V)纈第24頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構1）脂肪族氨基酸4一氨基一羧基氨基酸4普通名稱化學名英文名代號代號亮氨酸-氨基異己酸LeucineLeu(L)亮第25頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構1）脂肪族氨基酸5一氨基一羧基氨基酸5普通名稱化學名英文名代號代號異亮氨酸-氨基--甲基戊酸IleucineIle(I)異亮第26頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構1）脂肪族氨基酸6一氨基二羧基氨基酸1普通名稱化學名英文名代號代號天冬氨酸-氨基丁二酸AspartateAsp(D)天第27頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構1）脂肪族氨基酸7一氨基二羧基氨基酸2普通名稱化學名英文名代號代號谷氨酸-氨基戊二酸GlutamateGlu(E)谷第28頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構1）脂肪族氨基酸7含酰胺基氨基酸1普通名稱化學名英文名代號代號天冬酰胺AsparagineAsn(N)第29頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構1）脂肪族氨基酸9含酰胺基氨基酸2普通名稱化學名英文名代號代號谷氨酰胺GlutamineGln(Q)第30頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構1）脂肪族氨基酸10二氨基一羧基氨基酸1普通名稱化學名英文名代號代號精氨酸-氨基--胍基戊酸ArginineArg(R)精第31頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構1）脂肪族氨基酸11二氨基一羧基氨基酸2普通名稱化學名英文名代號代號鳥氨酸-二氨基戊酸OrnithineOrn鳥第32頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構1）脂肪族氨基酸12二氨基一羧基氨基酸3普通名稱化學名英文名代號代號賴氨酸，-二氨基己酸LysineLys(K)賴第33頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構1）脂肪族氨基酸13羥基氨基酸1普通名稱化學名英文名代號代號絲氨酸-氨基--羥基丙酸SerineSer(S)絲

第34頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構1）脂肪族氨基酸14羥基氨基酸2普通名稱化學名英文名代號代號蘇氨酸-氨基--羥基丁酸ThreonineThr(T)蘇第35頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構1）脂肪族氨基酸15含硫基氨基酸1普通名稱化學名英文名代號代號半胱氨酸-氨基--巰基丙酸CysteineCys(C)半胱第36頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構1）脂肪族氨基酸16含硫基氨基酸2普通名稱化學名英文名代號代號胱氨酸二(-氨基--巰基丙酸)CysteineCys-Cys胱第37頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構1）脂肪族氨基酸17含硫基氨基酸3普通名稱化學名英文名代號代號甲硫氨酸(蛋氨酸)-氨基--甲硫基丁酸MethionineMet(M)甲硫第38頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構2）芳香族氨基酸1普通名稱化學名英文名代號代號苯丙氨酸-氨基--苯基丙酸PhenylalaninePhe(F)苯丙第39頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構2）芳香族氨基酸2普通名稱化學名英文名代號代號酪氨酸-氨基--對羥苯基丙酸TyrosineTyr(Y)酪第40頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構3）雜環(huán)氨基酸1普通名稱化學名英文名代號代號組氨酸-氨基--咪唑基丙酸HistidineHis(H)組第41頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構3）雜環(huán)氨基酸2普通名稱化學名英文名代號代號色氨酸-氨基--吲哚基丙酸TryptophanTrp(W)色第42頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構3）雜環(huán)氨基酸3普通名稱化學名英文名代號代號脯氨酸四氫吡咯-2-羧酸ProlinePro(P)脯亞氨基酸第43頁/共256頁（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學結構3）雜環(huán)氨基酸4普通名稱化學名英文名代號代號羥脯氨酸4-羥基吡咯烷-2-羧酸HydroxprolineHyp羥第44頁/共256頁（二）氨基酸的分類2（據(jù)酸堿性質）酸性氨基酸天冬氨酸谷氨酸第45頁/共256頁（二）氨基酸的分類2（據(jù)酸堿性質）堿性氨基酸賴氨酸精氨酸組氨酸第46頁/共256頁（二）氨基酸的分類2（據(jù)酸堿性質）中性氨基酸

含一氨基一羧基的氨基酸，包括兩種酸性氨基酸產生的酰胺（谷氨酰胺和天冬酰胺）。第47頁/共256頁（二）氨基酸的分類3（據(jù)R基因極性）非極性氨基酸1苯丙氨酸胱氨酸蛋氨酸甘氨酸丙氨酸纈氨酸亮氨酸異亮氨酸脯氨酸色氨酸第48頁/共256頁（二）氨基酸的分類3（據(jù)R基團極性）非極性氨基酸2

甘氨酸按理屬于極性的，但因其α-碳上的氫受到易解離的α-氨基和α-羧基的影響，因此不體現(xiàn)極性。第49頁/共256頁（二）氨基酸的分類3（據(jù)R基團極性）極性氨基酸1不帶電荷的酪氨酸半胱氨酸絲氨酸蘇氨酸天冬酰胺谷氨酰胺第50頁/共256頁（二）氨基酸的分類3（據(jù)R基團極性）極性氨基酸2帶正電荷的(堿性氨基酸)賴氨酸精氨酸組氨酸第51頁/共256頁（二）氨基酸的分類3（據(jù)R基團極性）極性氨基酸3帶負電荷的(酸性氨基酸)天冬氨酸谷氨酸第52頁/共256頁（三）不常見的氨基酸-丙氨酸-氨基丁酸其他見：南大P75

工科P45表4-2H2N-CH2-CH2-COOHH2N-CH2-CH2-CH2-COOH第53頁/共256頁（四）氨基酸的一般理化性質1物理性質物理性狀：無色結晶物。熔點：熔點高，一般在200℃以上。溶解性：通常能溶于極性溶劑,而不溶于非極性溶劑;各種氨基酸在水中的溶解度差別很大，并能溶解于稀酸或稀堿中。第54頁/共256頁（四）氨基酸的一般理化性質2兩性解離和等電點1

氨基酸在溶液中主要以兼性離子形式存在CHRCOO－H3N+第55頁/共256頁（四）氨基酸的一般理化性質2兩性解離和等電點2加酸時CHRCOOHH3N+H+H+總電荷“+”第56頁/共256頁（四）氨基酸的一般理化性質2兩性解離和等電點3加堿時CHRCOO-H2N總電荷“－”O(jiān)H－OH－第57頁/共256頁（四）氨基酸的一般理化性質2兩性解離和等電點5

當溶液為某一pH值，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-數(shù)目正好相等時(凈電荷為0),這一pH值即為氨基酸的等電點，簡稱pI。在等電點時，氨基酸既不向正極也不向負極移動，即氨基酸處于兩性離子狀態(tài)。第58頁/共256頁（四）氨基酸的一般理化性質2兩性解離和等電點4COO－CHH3N+R+OH－+H+COO－CHH2NR+OH－+H+在酸性溶液中（pH＜pI）在晶體狀態(tài)或水溶液中（pH=pI）在堿性溶液中（pH＞pI）第59頁/共256頁（四）氨基酸的一般理化性質2兩性解離和等電點7丙氨酸pI的計算COO－CH+H+H3N+CH3K1COOHCHH3N+CH3COO－CHH2NCH3K2Ala+Ala±Ala－K1=[Ala±][H+]/[Ala+][Ala+]=[Ala±][H+]/K1K2=[Ala－][H+]/[Ala±][Ala－]=[Ala±]K2/[H+]到達等電點時，[Ala+]=[Ala－]∴[Ala±][H+]/K1=[Ala±]K2/[H+]，即：K1K2=[H+]2兩邊取負對數(shù)：－lg[H+]2=－lgK1－lgK2∵－lg[H+]

=pH－lgK1=pK1－

lgK1=pK2∴2pH=pK1＋pK2令pI為等電點時的pH，則：pI＝（pK1＋pK2）/2第60頁/共256頁（四）氨基酸的一般理化性質2兩性解離和等電點8天冬氨酸pI的計算Asp+Asp±Asp－COOHCHH3N+CH2COOHCOO－CHH3N+CH2COOHCOO－CHH2NCH2COOHK1KRK2Asp=COO－CHH2NCH2COO－等電點時為Asp±∴pI＝（pK1＋pKR）/2第61頁/共256頁（四）氨基酸的一般理化性質2兩性解離和等電點9賴氨酸pI的計算Lys++Lys+Lys±COOHCHH3N+(CH2)4NH3+COO－CHH3N+(CH2)4NH3+COO－CHH2N(CH2)4NH3+K1K2KRLys－COO－CHH2NCH2NH2等電點時為Lys±∴pI＝（pK2＋pKR）/2第62頁/共256頁（四）氨基酸的一般理化性質2兩性解離和等電點6側鏈不含解離基團的中性氨基酸，其等電點是它的pK’1和pK’2的算術平均值：pI=(pK’1+pK’2)/2同樣，對于側鏈含有可解離基團的氨基酸，其pI值也決定于兩性離子兩邊的pK’值的算術平均值。酸性氨基酸：pI=(pK’1+pK’R)/2堿性氨基酸：pI=(pK’2+pK’R)/2第63頁/共256頁（四）氨基酸的一般理化性質3芳香族氨基酸的紫外吸收光譜1構成蛋白質的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠紫外區(qū)(<220nm)均有光吸收。在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max＝275nm苯丙氨酸的max＝257nm色氨酸的max＝280nm第64頁/共256頁（四）氨基酸的一般理化性質3芳香族氨基酸的紫外吸收光譜2第65頁/共256頁（五）氨基酸的化學反應α-氨基參加的反應：亞硝酸反應、2，4-二硝基氟苯反應等。α-羧基參加的反應：疊氮、脫羧、成鹽、成酯反應。α-氨基和α-羧基共同參加的反應：茚三酮反應及成肽反應。側鏈R基參加的反應：第66頁/共256頁（五）氨基酸的化學反應1α│氨基參加的反應1與亞硝酸反應原理：自由氨基能與亞硝酸反應釋放出氮氣，每克分子的自由氨基可生成一克分子氮氣。在生產上常用此法來測定蛋白質的水解程度。RCHCOOHNH2+HNO2RCHCOOHOH+N2↑+H2O第67頁/共256頁（五）氨基酸的化學反應2α│氨基參加的反應2

AADNFB+多肽蛋白+HF

DNP-AADNP-多肽

DNP-蛋白原理：在弱堿性溶液中，氨基酸的α-氨基很容易與DNFB作用，生成穩(wěn)定的黃色DNP-氨基酸（2，4一二硝基苯氨基酸）,多肽或蛋白質N-末端氨基酸的α-氨基也能與DNFB反應用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質NH2末端氨基酸,亦稱Sanger反應。2，4一二硝基氟苯反應1第68頁/共256頁（五）氨基酸的化學反應2α│氨基參加的反應22，4一二硝基氟苯反應2RCHNH2+HF+NO2FNO2COOHRCHNCOOHHpH8~9NO2NO2DNP-氨基酸第69頁/共256頁（五）氨基酸的化學反應2α│氨基參加的反應22，4一二硝基氟苯反應35—二甲氨基萘磺酰氯（丹磺酰氯）可以來代替DNFB。因為它具有強烈的熒光，可用熒光光度計快速檢出，靈敏度高。O=S=OClCH3NCH3第70頁/共256頁（五）氨基酸的化學反應2α│氨基參加的反應2丹磺酰氯反應第71頁/共256頁（五）氨基酸的化學反應2α│氨基參加的反應3異硫氰酸苯脂反應1用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質NH2末端氨基酸,亦稱Edman反應。弱堿AAPITC+多肽蛋白AAPTC—多肽蛋白HFPTH-AA+少一個AA的多肽或蛋白異硫氰酸苯酯苯氨基硫甲酰--苯硫乙酰脲第72頁/共256頁（五）氨基酸的化學反應2α│氨基參加的反應3異硫氰酸苯脂反應2NH2CHCOR2NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2SNHCNHOCR1CHNCOCHNHSCR1PTH-氨基酸PTC-氨基酸HFpH8.3第73頁/共256頁（五）氨基酸的化學反應3α│氨基參加的反應1甲醛反應RCHNH3+COO－HCHORCHNH3+NHCH2OHHCHORCHNH3+N(CH2OH)2羥甲基氨基酸二羥甲基氨基酸用途：進行氨基酸的酸鹼滴定第74頁/共256頁（五）氨基酸的化學反應3α│羧基參加的反應疊氮反應YNHCHCOOHRNH2NH2+2H2OYNHCHCONHNHRHNO2YNHCHCON3R用途：可活化羧基，常用于人工合成肽過程。?；被狨；被岬碾卵苌秕；被岑B氮第75頁/共256頁（五）氨基酸的化學反應4α-氨基與α-羧基共同參加的反應1茚三酮水合茚三酮茚三酮反應1第76頁/共256頁（五）氨基酸的化學反應4α-氨基與α-羧基共同參加的反應1用途：常用于氨基酸的定性或定量分析茚三酮反應2還原茚三酮茚三酮藍紫色物質第77頁/共256頁（五）氨基酸的化學反應4α-氨基與α-羧基共同參加的反應1茚三酮反應3脯氨酸及羥脯氨酸與茚三酮反應產物N+黃色化合物第78頁/共256頁（五）氨基酸的化學反應4α-氨基與α-羧基共同參加的反應2成肽反應用途：是多肽和蛋白質生物合成的基本反應第79頁/共256頁三、肽鍵與肽1CH3CHNH2COOH+CH2OHCHNH2COOHH2OCH3CHNH2COCH2OHCHNHCOOH(酰氨鍵)－N端－C端CNOH肽鍵第80頁/共256頁三、肽鍵與肽2肽鍵

肽鍵就是由氨基酸的α-羧基與相鄰的氨基酸的α-氨基脫水縮合起來的鍵。第81頁/共256頁三、肽鍵與肽3肽肽:氨基酸通過肽鍵連結起來的化合物。二肽:兩個氨基酸形成的肽。三肽:三個氨基酸形成的肽。多肽:許多氨基酸形成的肽。蛋白質:多是組成氨基酸超過100個的多肽。氨基酸殘基:氨基酸由于形成肽鍵而失去了一分子水，因此表現(xiàn)出其分子的不完整。末端氨基和末端羧基：縮合后的氨基酸，只在肽的兩端有自由的α-氨基和α-羧基，簡稱N-端和C-端。第82頁/共256頁三、肽鍵與肽4肽鏈的命名肽鏈的命名：根據(jù)組成的氨基酸殘基來確定。規(guī)定從肽鏈的N-端殘基開始，依次稱為某氨基酰、氨基?！嘲被帷Ｈ纾航z氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸NH2SerGlyTryAlaLeuCOOHNH2

SerGlyTryAlaLeuCOOH第83頁/共256頁三、肽鍵與肽5二硫鍵1二硫鍵：是由二個半胱氨酸殘基的側鏈之間形成的。即胱氨酸的殘基中的二硫鍵。二硫鍵類型：可以使兩條單獨的肽鏈共價交聯(lián)起來（鏈間二硫鍵）；也可以使一條鏈的某一部分形成環(huán)（鏈內二硫鍵）。第84頁/共256頁三、肽鍵與肽5二硫鍵2二硫鍵半胱氨酸

胱氨酸H2半胱氨酸CHNH2COOHCH2SCHNH2COOHCH2S第85頁/共256頁三、肽鍵與肽5二硫鍵3鏈間二硫鍵NHCHCONHCHCONHCHCOR1R2CH2SSCH2NHCHCONHCHCONHCHCOR3R4二硫鍵HSCH2CHCOO－NH3+半胱氨酸第86頁/共256頁三、肽鍵與肽5二硫鍵2鏈內二硫鍵第87頁/共256頁第二節(jié)蛋白質分子的結構二、蛋白質一級結構的研究方法三、肽的人工合成原理一、蛋白質分子的一級結構

四、蛋白質的三維構象第88頁/共256頁一、蛋白質分子的一級結構1☆一級結構是氨基酸按一定的排列順序構成的蛋白質肽鏈骨架?！疃嚯逆湹陌被犴樞颉！疃嚯逆渻然蜴滈g二硫鍵的數(shù)目和位置。最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質生物功能的基礎。蛋白質是由數(shù)條多肽鏈組成。一級結構(Primarystructure)的含義第89頁/共256頁一、蛋白質分子的一級結構2第90頁/共256頁一、蛋白質分子的一級結構3胰牛胰島素的一級結構1第91頁/共256頁一、蛋白質分子的一級結構3

我國1965年在世界上第一個用化學方法人工合成的蛋白質就是這種牛胰島素。胰牛胰島素的一級結構2第92頁/共256頁二、一級結構的研究方法11.樣品必需純（>97%以上）。2.知道蛋白質的分子量。3.知道蛋白質由幾個亞基組成。4.測定蛋白質的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計算每種氨基酸的個數(shù)。5.測定水解液中的氨量，計算酰胺的含量。測定蛋白質的一級結構的要求第93頁/共256頁二、一級結構的研究方法2（一）測定氨基酸的組成（二）蛋白質的N-末端和C-末端的測定（三）二硫鍵的拆開和肽鏈的分離（四）肽鏈的部分水解和肽段的分離（五）肽段的氨基酸順序的測定（六）二硫鍵位置的確定第94頁/共256頁（二）蛋白質N-末端和C-末端測定1N-末端殘基的分析1二硝基氟苯（DNFB）法（α-氨基反應）Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進行鑒定。第95頁/共256頁（二）蛋白質N-末端和C-末端測定1N-末端殘基的分析2二甲基氨基萘磺酰氯（稱丹磺酰氯）法在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點是丹磺酰-氨基酸有很強的熒光性質，檢測靈敏度可以達到110-9mol。第96頁/共256頁（二）蛋白質N-末端和C-末端測定1N-末端殘基的分析3異硫氰酸苯酯（PITC）法

此法最大優(yōu)點是除去N末端氨基酸后剩下的肽鏈部分仍是完整的。因此，可以用來一步步地測定多肽鏈N末端的氨基酸順序。氨基酸分析儀就是根據(jù)此原理制成的。NH2CHCOR2NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2SNHCNHOCR1CHNCOCHNHSCR1第97頁/共256頁（二）蛋白質N-末端和C-末端測定1N-末端殘基的分析4氨肽酶法氨肽酶是從胰腺中提取是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個的向里水解。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應時間和氨基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而知道蛋白質的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。第98頁/共256頁（二）蛋白質N-末端和C-末端測定2C-末端殘基的分析1硼氫化鋰還原法(α-羧基反應)RCHCOOHNH2LiBH4

還原RCHCH2OHNH2α-氨基醇可以用層析法加以鑒定第99頁/共256頁（二）蛋白質N-末端和C-末端測定2C-末端殘基的分析2肼解法(α-羧基反應)

多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質而與C-端氨基酸分離。第100頁/共256頁（二）蛋白質N-末端和C-末端測定2C-末端殘基的分析3羧肽酶法1羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個的水解。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y。A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。但實際有時相連的氨基酸以相近的速度釋放，結果不好分析。第101頁/共256頁（二）蛋白質N-末端和C-末端測定2C-末端殘基的分析3羧肽酶法2氨基酸的釋放量（摩爾數(shù)）反應時間GlySerVal判斷序列-Val-Ser-Gly-COOH第102頁/共256頁（三）二硫鍵的拆開和肽鏈的分離1如果肽鏈之間是以二硫鍵交連的，或者雖然蛋白質分子由一條肽鏈構成，有鏈內的二硫鍵，則必須采取一些方法將二硫鍵拆開。最普遍的方法是用過量的巰基乙醇處理，然后用碘乙酸保護還原時生成的半胱氨酸巰基，以防它重新被氧化。二硫鍵拆開后形成的個別肽鏈，可能用紙層析、離子交換柱層析、逆流分溶、區(qū)帶電泳等方法進行分離。第103頁/共256頁（三）二硫鍵的拆開和肽鏈的分離2SH+SHSSHOCH2CH2SHICH2COOH

涉及反應pH8.0~9.0,室溫SCH2COO第104頁/共256頁（四）肽鏈部分水解和肽段分離此步驟是測定氨基酸順序工作中的一個關鍵步驟。通常是選擇了專一性很強的蛋白酶來完成的。最理想的酶是胰蛋白酶，它很容易得到結晶純品。胰蛋白酶專門水解由堿性氨基酸（賴氨酸或精氨酸）的羧基參加形成肽鍵。所以水解后的產物C-端為賴氨酸或精氨酸。經常使用的還有糜蛋白酶、胃蛋白酶及專一性較差的嗜熱菌蛋白酶、溴化氰等。各種酶的作用位點參見北大P122。多肽鏈經部分水解后，即降解成長短不一的較小肽段，這些肽段可以應用層析和電泳加以分離和提純。第105頁/共256頁（五）肽段的氨基酸順序的測定1

測定多肽鏈中分離出來的各個小肽段，可以應用化學方法或酶學方法測出其中的氨基酸順序。然后比較用不同方法獲得的幾套肽段的氨基酸順序，根據(jù)它們彼此有重疊的部分，確定每個肽段的適當位置。拼湊出整個肽鏈的氨基酸順序。

第106頁/共256頁（五）肽段的氨基酸順序的測定2肽順序A1B1A2B2

A3B3

A4Ala.Phe(丙-苯丙)Ala.Phe.Gly.Lys(甘-賴)Gly.Lys.Asn.Tyr(-天冬酰-酪)Asn.Tyr.Arg(-精)Arg.Tyr(-酪)Tyr.His(-組)His.Val(-纈)十肽順序Ala.Phe.Gly.Lys.Asn.Tyr.Arg.Tyr.His.Val第107頁/共256頁（六）二硫鍵位置的確定1一般可用蛋白酶或酸直接水解原來的蛋白質，從部分水解產物中分離出含有二硫鍵的肽段，所得到的肽段混合物可用Brown及Harltay的對角線電泳技術進行分離，確定二硫鍵位置。確定二硫鍵位置一般用胃蛋白酶水解原來的含二硫鏈的蛋白質。因為胃蛋白酶專一性較低，切點多，這樣生成的肽段（包括含有二硫橋的肽段）都比較小，后面的分離、鑒定工作均比較容易進行。其次是胃蛋白酶的pH在酸性范圍（～2），有利于防止二硫鍵發(fā)生交換反應而造成麻煩。第108頁/共256頁（六）二硫鍵位置的確定2Brown和Hartlay對角線電泳圖解+-+-第二向第一向abpH6.5圖中a、b兩個斑點是由一個二硫鍵斷裂產生的肽段第109頁/共256頁三、肽的人工合成原理1（總合成步驟）1．加保護基Y，保護氨基酸甲的自由氨基（-NH2）。2．加保護基Z，保護氨基酸乙的自由羧基(-COOH)(此反應同時活化了氨基）。3．加活化基X，使加保護基Y的氨基酸甲的羧基活化。4．使-NH2被保護羧基被活化的氨基酸甲，同羧基被保護氨基被活化的氨基酸乙結合成肽。5．脫保護基Y和Z。

第110頁/共256頁三、肽的人工合成原理2（分合成步驟）

1．加保護基Y來保護氨基酸甲的自由氨基（-NH2）。R1CHCOO－＋YNH3＋R1CHCOO－Y.NH第111頁/共256頁三、肽的人工合成原理2（分合成步驟）

2．加保護基Z來保護氨基酸乙的自由羧基(-COOH)(此反應同時活化了氨基）。R1CHCOO－＋ZNH3＋R1CHCOOZNH2第112頁/共256頁三、肽的人工合成原理2（分合成步驟）

3．加活化基X使加保護基Y的氨基酸甲的羧基活化。R2CHCOO－+XY.NHR2CHCOXY.NH第113頁/共256頁三、肽的人工合成原理2（分合成步驟）

4．使-NH2被保護羧基被活化了的氨基酸甲,同羧基被保護氨基被活化了的氨基酸乙結合成肽。R2CHCOOZNH2R1CHCOX＋Y.NHR1CHCOY.NHR2CHCOOZ＋HXNH第114頁/共256頁三、肽的人工合成原理2（分合成步驟）

5．脫保護基Y和Z。R1CHCOY.NHR2CHCOOZ＋HXNH

脫保護基劑R1CHCONH3+R2CHCOO－NH第115頁/共256頁三、肽的人工合成原理3（肽鏈的延長)

如果欲再延長肽鏈，可將保護基Y或Z去掉一個，所得含自由氨基或自由羧基的肽，按照上述3,4步進行即可。第116頁/共256頁三、肽的人工合成原理4（常用X,Y,Z)常見的氨基保護基Y：對甲苯磺?；╰osyl或Tos基）、芐氧羰基(C6H5CH2O—CO-，CbZ基)。叔丁氧羰基(CCH3)3CO-CO-，Boc基）或三苯甲基（C6H5）3-C即lrityl基。羧基活化基X：可用PCl5使氨基酸酰氯化，即將羧基變?yōu)椤狢OCl基。也可用聯(lián)氨和HNO2使羧基疊氮化成-CON3。羧基保護基Z：可用酯化或皂化使羧基變?yōu)?COOC2H5或-COONa，此反應同時亦活化了氨基。第117頁/共256頁三、肽的人工合成原理5（合成方法)液相合成法：合成在溶液中進行，這種方法費力，目前不被采用。固相合成法：采用固相支持物，反應在支持物上進行。常用的支持物如：苯乙烯與二乙烯基苯的共聚物，再經氯甲基化而成，簡稱氯甲基聚乙烯樹脂。（利用樹脂合成肽的流程見南大P100）。第118頁/共256頁多肽的合成1第119頁/共256頁多肽的合成2第120頁/共256頁四、蛋白質的三維構象1(目錄）(一)研究構象的方法(二)蛋白質分子的二級結構(三)蛋白質的三級結構

(四)蛋白質分子的四級結構第121頁/共256頁四、蛋白質的三維構象2(定義）

蛋白質分子的三維構象也稱空間結構或高級結構。指的是蛋白質分子中原子基團在三維空間上的排列、分布及肽鏈的走向。

第122頁/共256頁四、蛋白質的三維構象3(示例1蛋白酶抑制劑）第123頁/共256頁四、蛋白質的三維構象3(示例2蝦紅素）第124頁/共256頁四、蛋白質的三維構象3(示例3木瓜及組織蛋白酶）第125頁/共256頁四、蛋白質的三維構象3(示例4雞半胱氨酸抑制劑）第126頁/共256頁四、蛋白質的三維構象3(示例5）第127頁/共256頁(一)研究構象的方法1

其原理與光學顯微鏡或電子顯微鏡的原理基本相似，但光源波長很短。λ=0.154nm，為一衍射波，得到一張衍射圖。經數(shù)學方法重組，繪出電子密度圖，從中構建出三維分子圖象——分子結構模型。

1．X-射線衍射法：第128頁/共256頁(一)研究構象的方法22．重氫交換法和旋光色散法：測定蛋白質分子中α-螺旋體的含量。3．核磁共振光譜法：測定蛋白質分子中哪個氨基酸殘基發(fā)生構象變化。4．園二色法：測定α-螺旋和β-折疊片的含量。5．熒光、熒光偏振法等

第129頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構1定義：蛋白質的二級結構是指蛋白質多肽鏈（一級結構）本身的折疊和盤繞的方式。類型：天然蛋白質一般均含有α-螺旋、β-折疊和β-轉角的結構。

第130頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2維持蛋白質分子構象的化學鍵1（1）氫鍵：一個氫原子連接兩個電負性強的原子（如氧、氮等）。其中一個為共價鍵，另一個即為氫鍵。在α-螺旋和β-折疊中占有極重要的地位，對蛋白質分子三維構象的維護也很重要。（2）靜電引力：正負帶電基團之間的吸引力，如NH4+與COO-。靜電引力較強，但對蛋白質分子三維構象的穩(wěn)定貢獻不是很大，有時也稱為離子鍵或鹽鍵。第131頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2維持蛋白質分子構象的化學鍵2（3）范德華力：是分子間的吸引力，是原子團相互接近時誘導產生的。它變化多樣，對維持蛋白質活性中心的構象影響很大。（4）疏水相互作用：是非極性基團為了避開水相而群集在一起的作用力。疏水作用是維持蛋白質高級結構的重要因素。第132頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2維持蛋白質分子構象的化學鍵3（5）二硫鍵（二硫橋）：兩個硫原子之間形成的共價鍵。此鍵作用很強，可把不同肽鏈或同一條肽鏈的不同部分連在一起，對穩(wěn)定蛋白質構象起重要作用。大多數(shù)蛋白質分子由于二硫鍵的斷裂其生物學活性隨即喪失。維持蛋白質構象的化學鍵主要是次級鍵（氫鍵、離子鍵、疏水作用和范德華力）。這些次級鍵是非共價鍵。肽鍵、二硫鍵、酯鍵等被稱之為共價鍵。第133頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2二級結構的類型1（1）-螺旋最常見的二級結構形式。第134頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2二級結構的類型1（1）-螺旋特點1①每隔3.6個氨基酸殘基，螺旋上升一圈。上升一圈相當于向上平移0.54nm，即每個氨基酸殘基上升0.15nm，每個殘基沿軸旋轉1000。第135頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2二級結構的類型1（1）-螺旋特點2②氨基酸殘基側鏈伸向外側，相鄰螺圈之間形成鏈內氫鍵。氫鍵是由每個氨基酸殘基的N-H與前面隔三個氨基酸殘基的C=0形成的。第136頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2二級結構的類型1（1）-螺旋特點3③一般為右手螺旋。第137頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2二級結構的類型1（1）-螺旋特點4④鏈中如有脯氨酸，則螺旋被中斷，產生一個“結節(jié)”，這是因為脯氨酸的亞氨基上的氫參與肽鍵形成后沒有多余的氫原子形成氫鍵，這樣肽鏈拐彎不再形成α-螺旋。脯氨酸第138頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2二級結構的類型1（1）-螺旋特點5⑤另外，甘氨酸由于沒有側鏈的約束，難以形成α-螺旋所需的二面角。其次，如肽鏈中連續(xù)存在帶相同電荷的氨基酸，由于同性電荷相斥也會影響α-螺旋不穩(wěn)定。甘氨酸第139頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2二級結構的類型1（1）-螺旋第140頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2二級結構的類型2（2）β-折疊結構

當將α-角蛋白（α-螺旋）用熱水和稀堿等方法處理或用力拉直，α-角蛋白就變成β-角蛋白，此時α-螺旋被伸展，氫鍵被破壞，而形成β-折疊。

第141頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2二級結構的類型2（2）β-折疊結構特點1-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構象。第142頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2二級結構的類型2（2）β-折疊結構特點2在-折疊中，-碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的R基團處于折疊的棱角上并與棱角垂直，兩個氨基酸之間的軸心距為0.35nm。第143頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2二級結構的類型2（2）β-折疊結構特點3

-折疊結構的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。第144頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2二級結構的類型2（2）β-折疊結構特點4

平行式反平行式所有肽鏈的N-端都在同一邊相鄰兩條肽鏈的方向相反第145頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2二級結構的類型2（2）β-折疊結構

側面觀第146頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2二級結構的類型3（3）β-轉角結構1這類結構主要存在于球狀蛋白分子中。-轉角部分，由四個氨基酸殘基組成彎曲處的第一個氨基酸殘基的-C=O和第四個殘基的–N-H之間形成氫鍵，形成一個不很穩(wěn)定的環(huán)狀結構。第147頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2二級結構的類型3（3）β-轉角結構2

β-轉角第148頁/共256頁（二）蛋白質分子的二級結構2二級結構的類型3

α螺旋β折疊片β轉角自由回轉第149頁/共256頁（三）蛋白質的三級結構1

定義：蛋白質的三級結構(TertiaryStructure)是蛋白質在各種二級結構單元的基礎上，還能進一步盤曲而成特定格式的三級結構。維系力：主要有氫鍵、疏水鍵、離子鍵和范德華力等。尤其是疏水鍵，在蛋白質三級結構中起著重要作用。第150頁/共256頁（三）蛋白質的三級結構2三級結構的維系因素決定多肽鏈盤曲方式（高級結構）的因素，首先是氨基酸殘基的序列（一級結構）。鹽鍵:殘基上氨基酸有的帶正電（賴、精），與帶負電的氨基酸（谷、天冬）的相互吸引。范德華力：因基團之間的緊密靠近而產生。氫鍵：側鏈之間可形成氫鍵。二硫鍵:可把兩條肽段連起來，是維持蛋白質的三級結構的重要因素。多肽鏈經過如此盤曲后，在分子表面形成了某些發(fā)揮生物學功能的特定區(qū)域（微環(huán)境），如酶的活性中心等。第151頁/共256頁（三）蛋白質的三級結構3維持三級結構的作用力1第152頁/共256頁（三）蛋白質的三級結構3維持三級結構的作用力2無三級結構形成三級結構第153頁/共256頁（三）蛋白質的三級結構3維持三級結構的作用力3

肽鍵

二硫鍵離子鍵

氫鍵疏水鍵

范德華力

90kcal/mol3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol這四種鍵能遠小于共價鍵，稱次級鍵。次級鍵微弱但卻是維持蛋白質三級結構中主要的作用力,原因是因為其數(shù)量巨大。第154頁/共256頁（三）蛋白質的三級結構4

第155頁/共256頁（三）蛋白質的三級結構5

肌紅蛋白的三級結構第156頁/共256頁（四）蛋白質分子的四級結構1

很多蛋白質分子是由兩個或兩個以上獨立的、具有三級結構的多肽鏈組成的。這些多肽鏈之間并沒有共價鍵的聯(lián)系，只是借次級鍵締合在一起，這就形成了四級結構。一般分子量超過幾十～一百萬的蛋白質均有四級結構。在四級結構的蛋白質分子中，每個具有三級結構的多肽鏈單位稱為亞基，亞基多無生物學活性，具有完整四級結構的蛋白質分子才有生物活性。第157頁/共256頁（四）蛋白質分子的四級結構2

第158頁/共256頁（四）蛋白質分子的四級結構3

血紅蛋白中四亞基兩兩相同，分別稱為α1、α2、β1、β2血紅細胞第159頁/共256頁（四）蛋白質分子的四級結構4血紅蛋白中的二聚體之一α2與β2第160頁/共256頁第三節(jié)蛋白質的理化性質一、蛋白質的分子量二、兩性游離和等電點三、蛋白質的膠體性質四、蛋白質的沉淀反應五、蛋白質的變性和復性六、蛋白質的顏色反應第161頁/共256頁一、蛋白質的分子量蛋白質的分子量一般在1萬—100萬道爾頓由于是生物大分子，因此在溶液中極不穩(wěn)定，不能用測定小分子物質的方法（如冰點降低、沸點升高）來測定一般以滲透壓法、凝膠過濾、聚丙烯酰胺凝膠電泳及超離心法來測定其分子量。超離心法較準確，但實驗條件要求很高第162頁/共256頁二、兩性游離和等電點1+OH－+H++OH－+H+COOHPrH3N+COO－PrH3N+COO－PrH2NpH＜pI4＜7pH=pI7=7pH＞pI9＞7

由于蛋白質是由氨基酸組成，氨基酸所具有的兩性游離性質，蛋白質也同樣具有第163頁/共256頁二、兩性游離和等電點2肽與氨基酸都有α－COOH，α－NH2，但肽還含有側鏈R基上的可解離基團，且其為主要解離基團。肽鏈中的α－COOH與α－NH2相距較遠，因此它們之間的靜電引力較弱，可離子化程度較低。大的肽比小肽的離子化程度低，即大肽完全質子化所需pH比小肽低。N端α－NH2的pK，值比游離氨基酸的小，C－端的α－COOH的pK，值比游離氨基酸的大，側鏈R基的pK，值在兩者之間。蛋白質兩性游離的特點第164頁/共256頁二、兩性游離和等電點3在同一pH溶液中，由于各種蛋白質所帶電荷的性質和數(shù)量以及分子大小不同，因此它們在電場中的移動速度也有差別，可以利用這種性質來分離和分析蛋白質，稱為蛋白質電泳分析法。常用的有紙上電泳、醋酸纖維膜電泳、聚丙烯纖維的凝膠電泳蛋白質兩性游離的應用1第165頁/共256頁二、兩性游離和等電點3蛋白質兩性游離的應用2電泳第166頁/共256頁三、蛋白質的膠體性質1

由于蛋白質分子大，且球狀蛋白質分子中親水的氨基酸殘基多位于顆粒表面，故在水溶液中能與水起水合作用。因此，蛋白質的水溶液具有親水膠體的性質為什么蛋白質具有膠體性質第167頁/共256頁三、蛋白質的膠體性質2蛋白質所形成的親水膠體顆粒具有二個穩(wěn)定因素，即顆粒表面的水化層和電荷。若無外力條件作用，不致互相凝集。如除掉這兩個穩(wěn)定因素，蛋白質便容易凝集析出。因此，可用此原理提取蛋白質，如常用中性鹽硫酸胺來競爭水而使水化膜破裂，產生沉淀。蛋白質膠體穩(wěn)定的原因第168頁/共256頁三、蛋白質的膠體性質3蛋白質具有許多高分子溶液的性質。如擴散、粘度大、不能透過半透膜。利用不能透過半透膜的性質可以將蛋白質和其他一些小分子分開，常用方法有滲析和超濾。第169頁/共256頁三、蛋白質的膠體性質4滲析血液透析小分子溶出小分子被帶出透析機透析液血液加壓第170頁/共256頁三、蛋白質的膠體性質4超濾第171頁/共256頁四、蛋白質的沉淀反應1(概述)定義:使蛋白質從溶液中析出的現(xiàn)象。原理:蛋白質穩(wěn)定因素有水化層和帶電層,水化層是蛋白質分子表面的許多親水基團與水分子結合形成的一層水膜，它使蛋白質顆粒不能相互接觸聚集成大顆粒；帶電層是蛋白質分子表面的可解離基團在一定pH環(huán)境下解離產生的。由于帶同性電荷的蛋白質顆粒相互排斥，也使蛋白質顆粒不能聚集，當改變這些穩(wěn)定因素，蛋白質分子相聚集而從溶液中析出。

特點:一般沉淀出的蛋白質是變性的。如果控制實驗條件（如低溫、溫和沉淀劑），便可得到不變性的蛋白質。第172頁/共256頁四、蛋白質的沉淀反應2(方式1)定義:加入大量中性鹽(硫酸胺)以破壞蛋白質的膠體性質而使蛋白質從水溶液沉淀析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質的等電點(溶解度最小，易沉淀)則效果最好。各種蛋白質分子的顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣。因此，調節(jié)混合蛋白質的溶液中的中性鹽的濃度，可使各種蛋白質分段沉淀。1．鹽析1第173頁/共256頁四、蛋白質的沉淀反應2(方式1)1．鹽析2蛋白質分子表面的疏水區(qū)域，聚集了許多水分子，鹽濃度高時，它們被鹽抽出，暴露出的疏水區(qū)域相互結合，沉淀第174頁/共256頁四、蛋白質的沉淀反應2(方式2)pH稍大于等電點為宜，因為此時蛋白質帶負電，易與金屬離子結合成鹽。通常這種沉淀為變性的，如控制溫度（低溫）并控制重金屬離子濃度，則可用于分離制備不變性的蛋白質。

2．重金屬鹽沉淀蛋白質第175頁/共256頁四、蛋白質的沉淀反應2(方式3)某些生物堿試劑（如苦味酸、鎢酸、鞣酸、碘化鉀等）及某些酸（三氯乙酸、水楊磺酸、硝酸等）與蛋白質結合成不溶性的鹽沉淀。沉淀條件應當是pH小于等于電點，這樣蛋白質帶正電，易與酸根負離子結合成鹽。3．生物堿試劑與某些酸類沉淀蛋白質第176頁/共256頁四、蛋白質的沉淀反應2(方式4)可與水混合的有機溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等能破壞蛋白質的膠體性質而使蛋白質沉淀。如酒精的消毒作用。在低溫條件下，變性進行較緩慢，可以用來制備蛋白質。其優(yōu)點在于：不像鹽析那樣存在有大量鹽類，必須經透析除去，而且有機溶劑很易通過稀釋透析及蒸發(fā)等方法除去。4．有機溶劑沉淀蛋白質第177頁/共256頁四、蛋白質的沉淀反應2(方式5)將接近于等電點附近的蛋白質溶液加熱可使蛋白質發(fā)生凝固而沉下。雞蛋煮熟后，本來流動的蛋清、蛋黃都變成固體樣的東西了。這是蛋白質凝固作用應用于食品加工的典型例子。5．加熱凝固第178頁/共256頁五、蛋白質的變性和復性（變性1）定義:以某些物理或化學因素的作用，使蛋白質嚴格的空間構象破壞（不包括肽鍵的斷裂），而引起蛋白質若干理化和生物學性質的改變。影響蛋白質變性的因素:紫外線照射、加熱煮沸、強酸、強堿、重金屬鹽和有機溶劑處理等。原理:維持蛋白質二級、三級和四級結構的嚴格構象的力只是一些弱的次級鍵，它們很容易被破壞。特點:天然構象被破壞，蛋白質失去了生物學活性。第179頁/共256頁五、蛋白質的變性和復性（變性2）第180頁/共256頁五、蛋白質的變性和復性（變性3）第181頁/共256頁五、蛋白質的變性和復性（復性）復性:某些變性蛋白質，再除去變性因素后，可以重新獲得其天然結構和生物活性，稱為蛋白質的“復性”。如有一些球蛋白被熱或極端pH變性后，若緩慢冷卻或緩慢恢復到正常pH時，將重新獲得其天然結構和生物活性。這種復性現(xiàn)象，即蛋白質折疊研究中的所謂“折疊”。第182頁/共256頁六、蛋白質的顏色反應11.雙縮脲反應1原理:蛋白質分子中含有許多和雙縮脲結構相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應，形成紅紫色混合物。應用:可以用此反應來定性測定蛋白質；也可在540nm處比色，定量測定蛋白質。第183頁/共256頁六、蛋白質的顏色反應12H2N－C－NH2H2N－C－N－C－NH2＋NH3↑1320COOHO尿素雙縮脲雙縮脲CuSO4+NaOH紫紅色物質1.雙縮脲反應2第184頁/共256頁六、蛋白質的顏色反應22.酚試劑（福林試劑）反應原理:蛋白質分子一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能將福林試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍色化合物（鉬藍和鎢藍的混合物）應用:常用此反應來定量測定蛋白質含量。最近普遍使用的Brodford法,（考馬思亮蘭G-250法）將會在以后的實驗接觸。第185頁/共256頁六、蛋白質的顏色反應3含有芳香族氨基酸，特別是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白質所特有的呈色反應。蛋白質溶液遇硝酸后先產生白色沉淀，加鹽則白色沉淀變成黃色，再加堿呈橙黃色。因為硝酸將蛋白質分子中的苯環(huán)硝化，產生了黃色硝基苯衍生物3．蛋白質的黃色反應1第186頁/共256頁六、蛋白質的顏色反應33．蛋白質的黃色反應2

硝基酚（黃色）

鄰硝醌酸鈉（橙黃色）第187頁/共256頁六、蛋白質的顏色反應44．米倫化反應米倫試劑為硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸和亞硝酸的混合液。當?shù)鞍兹芤褐屑尤朊讉愒噭┖蠹串a生白色沉淀，加熱后沉淀變成紅色。由于酚類化合物有此反應，酪氨酸含有酚基，故有此反應。第188頁/共256頁六、蛋白質的顏色反應5．乙醛酸反應1在蛋白質溶液中加入乙醛酸，并沿試管壁慢慢注入濃硫酸，在兩液層之間就會出現(xiàn)紫色環(huán)。凡含有吲哚基的化合物都有此反應，由于色氨酸含有類似結構，因此含有色氨酸或含色氨酸的蛋白質都有此反應。第189頁/共256頁六、蛋白質的顏色反應5．乙醛酸反應2第190頁/共256頁六、蛋白質的顏色反應66．坂口反應1原理:精氨酸分子中的胍基，能與次氯酸鈉、或次溴酸鈉及α－萘酚在氫氧化鈉溶液中產生紅色產物。應用:此反應可以用來鑒定含有精氨酸的蛋白質，也可用來測定精氨酸的含量。第191頁/共256頁六、蛋白質的顏色反應66．坂口反應2紅色第192頁/共256頁六、蛋白質的顏色反應66．坂口反應3第193頁/共256頁第四節(jié)氨基酸及蛋白質分離提純1無論是對蛋白質結構與功能的研究，或是生產人們所需要的蛋白質產品，都涉及蛋白質的分離純化。目前對蛋白質的制備，主要是從生物組織中提取分離。一般的程序為：前處理：組織、細胞破碎等。粗分級：鹽析、沉淀等。細分級：層析、電泳等。第194頁/共256頁第四節(jié)氨基酸及蛋白質分離提純2一、氨基酸的分析分離

二、蛋白質混合物的分離方法

三、蛋白質的鑒定

第195頁/共256頁一、氨基酸的分析分離1類型：分配層析法(包括柱層析、紙層析和薄層層析)基本原理：所有的層析系統(tǒng)通常都由兩個相組成，一個為固定相的或靜相；一個為流動相或動相。第196頁/共256頁一、氨基酸的分析分離2分配系數(shù)Kd

：混合物在層析系統(tǒng)中的分離，決定于該混合物的組分在兩相中的分配情況，即分配系數(shù)：

Kd=CA/CBCA，CB分別代表某一物質在互不相溶的兩相A，B中的濃度。第197頁/共256頁一、氨基酸的分析分離2分配系數(shù)Keff：某一物質在層析系統(tǒng)中的行為并不直接決定于它們的分配系數(shù)Kd,而是取決于有效分配系數(shù)Keff。Keff＝某物質在A相中的總量/某物質在B相中的總量對于液相-液相層析系統(tǒng)來說,Keff＝(CA×VA)/(CB×VB)＝Kd×RV這里的VA,VB分別為A相和B相的體積，RV為A，B兩相的體積比。由此可見，Keff是RV的函數(shù)，溶質的有效分配系數(shù)可以調整兩相的體積比而加以改變。第198頁/共256頁一、氨基酸的分析分離3

利用層析法分離混合物（例如氨基酸混合物），其先決條件是各種氨基酸成分的分配系數(shù)要有差異，哪怕是很小的差異，一般差異越大，越容易分開。

第199頁/共256頁一、氨基酸的分析分離41．分配柱層析2．濾紙層析3．薄層分析4．離子交換層析5．氣相色譜6．高效液相色譜（HPLC）第200頁/共256頁1．分配柱層析1柱層析中的填充物或稱支持劑，都是一些具有親水性的不溶物質，如纖維素、淀粉、硅膠等。以它們作為固定相（靜相）。用各種緩沖液（流動相）來溶出。在柱上端加上氨基酸混合物樣品，那么此樣品就會在兩相之間發(fā)生連續(xù)分配,混合物中具有不同分配系數(shù)的各種成分沿柱以不同的速度向下移動。分步收集柱下端的洗出液，用茚三酮顯色定量。以氨基酸對洗出液體積作圖，得洗脫曲線，曲線中的每個峰相當于某一種氨基酸。第201頁/共256頁1．分配柱層析2洗脫劑樣品填充物玻璃柱分步收集設想的板層S=固定相M=流動相第202頁/共256頁1．分配柱層析3ABCDE321616816841241228812212345階段第203頁/共256頁1．分配柱層析4分溶曲線與轉移次數(shù)（理論板數(shù)）n的依賴關系00.250.50.751.0相對濃度n=6n=100n=1000第204頁/共256頁2．濾紙層析1濾紙上，水被吸附在纖維素的纖維之間，形成固定相，展層用的溶劑是流動相。層析時，混合氨基酸在這兩相中不斷分配，使它們分布在濾紙的不同位置，然后用茚三酮顯色。此層析可以進行二向層析。第一向層析完成后，烘干濾紙再用另一溶劑層析（與第一向層析相垂直）。這種方法不僅可用于氨基酸分析，還可用于糖的分析和核苷酸的分析，是一個非常有用的方法。第205頁/共256頁2．濾紙層析2AA1A