分子醫(yī)學(xué)技能-實(shí)驗(yàn)二PCR試劑盒檢測(cè)HBVDNAapoB基因檢測(cè)PCR基本原理及相關(guān)知識(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）是一種體外擴(kuò)增特異DNA片斷的技術(shù),能在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)百萬(wàn)個(gè)特異DNA序列的拷貝。KaryMullis

PCR技術(shù)最早由美國(guó)Cetus公司人類遺傳研究室KaryMullis及同事于1985年發(fā)現(xiàn)并研制成功的。KaryMullis因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”而獲得1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

相對(duì)DNA克隆而言，這種方法的特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、時(shí)間短、特異性高、靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、分子生物學(xué)、分子克隆、基因診斷、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。

PCR擴(kuò)增DNA片段的原理

PCR是在模板DNA、引物和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)，整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程分三步：

①變性：加熱，模板DNA形成兩條單鏈②退火：降溫，模板單鏈DNA與引物配對(duì)結(jié)合③延伸：在DNA聚合酶及鎂離子等存在的條件下，引物3'-端向前延伸，合成與模板配對(duì)的新鏈

上述三步為一個(gè)循環(huán)，經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)DNA量增加一倍。新合成的鏈又可以成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過(guò)25-30個(gè)循環(huán)后目的DNA就可以擴(kuò)增106~109倍。

通過(guò)循環(huán)可以提高PCR的特異性。PCR反應(yīng)體系的組成及功能

完整的PCR反應(yīng)體系包括：模板：?jiǎn)?、雙鏈DNA均可，不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。相對(duì)于分子克隆、酶切、連接、標(biāo)記等，PCR對(duì)DNA模板純度的要求并不嚴(yán)格。模板用量也是很低的，一般認(rèn)為102~104拷貝模板就可以滿足要求。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。引物

是預(yù)擴(kuò)增DNA片段兩端的已知序列，是保證PCR特異性的關(guān)鍵因素，引物濃度：0.1-0.5mol/L，濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。TaqDNA聚合酶

有良好的熱穩(wěn)定性，具有5‘-3’聚合酶活性和3‘-5’外切酶活性，因此。它對(duì)核苷酸的錯(cuò)配是沒(méi)有校正功能。

其活性對(duì)Mg2+濃度非常敏感

終濃度一般為：2.5u/100ul，酶量增加使反應(yīng)特異性下降；酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量。

dNTP：

已有商品化的混合液，終濃度一般為20~200umol/L。10×PCR反應(yīng)buffer：

已作成商品化的產(chǎn)品，它包括：250~500mmol/LKCl；100~500mmol/LTris-HAC（pH8.4）；15~20mmol/LMgCl2（對(duì)Taq酶的活性影響很大，一般濃度為1.5~2.0mmol/L，實(shí)際應(yīng)用時(shí)根據(jù)反應(yīng)體系的情況進(jìn)行調(diào)整。）；

0.1%明膠或牛血清白蛋白ddH2O調(diào)節(jié)反應(yīng)體積液體石蠟油影響PCR的主要因素

PCR反應(yīng)體系的各個(gè)組分PCR循環(huán)的溫度（預(yù)變性、變性、退火、延伸）PCR循環(huán)的次數(shù)和平臺(tái)效應(yīng)

操作環(huán)境平臺(tái)效應(yīng)及其原因

遺傳多態(tài)現(xiàn)象(geneticpolymorphism)

是指同一交配繁殖群體中存在兩種或兩種以上遺傳變異的類型,其中頻率最低的類型并不依靠重復(fù)突變維持。

染色體多態(tài)現(xiàn)象

蛋白質(zhì)多態(tài)現(xiàn)象DNA多態(tài)現(xiàn)象DNA多態(tài)現(xiàn)象產(chǎn)生的原因單個(gè)核苷酸的點(diǎn)突變即核苷酸的替換單一DNA序列的插入或缺失整串DNA序列的插入或缺失基因轉(zhuǎn)換DNA多態(tài)現(xiàn)象的類型RFLP(restrictedfragmentlengthpolymorphism)RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)微衛(wèi)星多態(tài)性(microsatellitepolymorphism)SSCP(singlestrandconformationpolymorphism)DSCP(doublestrandconformationpolymorphism)DNA芯片(DNAchips)DNA指紋隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)

由Williams等于1990年創(chuàng)立。其基本原理與PCR技術(shù)一致；由人工隨機(jī)合成的DNA分子為引物，以基因組DNA為模板，進(jìn)行多態(tài)性DNA片段的隨機(jī)合成。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、染色分析，就可直接在紫外光線下看到新合成的DNA分子片段形成的不同條帶。遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有可能導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。若PCR產(chǎn)物增加或缺少，則產(chǎn)生RAPD標(biāo)記。不同品種雞基因組的RAPD分析圖關(guān)于apoB基因獨(dú)立于2號(hào)染色體短臂末端，編碼apoB蛋白質(zhì)全長(zhǎng)43kb(28個(gè)內(nèi)含子，29個(gè)外顯子）apoB基因DNA多態(tài)性或遺傳變異

高膽固醇血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、

心梗、冠心病、肥胖apoB基因只要有微小變異（缺陷）都可以引起高膽固醇和高甘油三酯血癥實(shí)驗(yàn)操作

實(shí)驗(yàn)分組，認(rèn)清試劑（每2人一小組，一人做乙肝病毒PCR）一人做apoBD)

患者血清40l+40lDNA提取液，混勻（2大組做一份）

沸水浴10min，10000rpm×5min（離心機(jī)的使用）

取上清2l（或陽(yáng)性血清2l）加入一PCR反應(yīng)管6000rpm×10s，混勻PCR儀上，93℃×3min預(yù)變性(HemaPCR儀的使用與程序設(shè)計(jì))

93℃×45s，55℃×35s，72℃×60s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)

72℃保溫5min，-20℃保存?zhèn)溆胊poB(用個(gè)人基因組DNA為模板）2*混合液12.5μl引物2μlDNA模板4