關(guān)于基因的分離與鑒定第一頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日DNA克隆片段的產(chǎn)生和分離重組體DNA分子的構(gòu)建及導(dǎo)入受體細(xì)胞基因克隆的實(shí)驗(yàn)方案克隆基因的分離重組子的選擇與鑒定第二頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日克隆基因的分離

1.應(yīng)用核酸探針

2.應(yīng)用差別雜交或扣除雜交法

3.應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)

4.應(yīng)用表達(dá)文庫(kù)

5.酵母雙雜交體系第三頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

應(yīng)用核酸探針?lè)蛛x克隆的目的基因第四頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日步驟：1.獲得探針2.轉(zhuǎn)膜3.雜交第五頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日TransfertheDNAintheplaqueorcolonytoaNylonornitrocellulosemembranePhageDNAbindtothemembranedirectly

BacterialcoloniesmustbelysedtoreleaseDNAonthemembranesurface.Hybridization

(inasolutionContainingNucleicacidprobe)Washto

removeunhybri-dizationprobeand

visualize

X-rayfilm(radio-activelylabeled

)

antibodyorenzyme(modifiednucleotidelabeled

Lineup

thehybridizatedregionorrepeatedhybridization(Alkalitreatment)第六頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日探針的來(lái)源1.某種生物實(shí)驗(yàn)體系中分離到的基因序列，可作為從其它生物中分離相關(guān)基因的核酸探針。

2.根據(jù)蛋白質(zhì)家族保守性，合成核酸探針。功能相同或相近的蛋白質(zhì)，存在著具有共同氨基酸序列的區(qū)段（保守區(qū)），往往由彼此相鄰的6~7個(gè)氨基酸組成。

第七頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日寡核苷酸探針的人工合成

1.探針的長(zhǎng)度；要使探針與目的基因序列嚴(yán)格互補(bǔ)，最少的探針長(zhǎng)度15~16個(gè)核苷酸，實(shí)驗(yàn)中為保證足夠的特異性，通常使用17~20個(gè)核苷酸。

2.簡(jiǎn)并性；根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸組分合成的寡核苷酸探針，通常是混合物的形式。在這種探針庫(kù)中，只有一種是與目的基因完全互補(bǔ)的。第八頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

由于探針庫(kù)中只有一種是與目的基因完全互補(bǔ)的，其它的探針有可能與不相關(guān)的片斷雜交，產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。

1.猜測(cè)體探針

2.PCR-猜測(cè)體探針第九頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

猜測(cè)體：一種人工合成的用于分離克隆基因的低簡(jiǎn)并性的寡核苷酸探針，其核苷酸序列是根據(jù)特定物種當(dāng)中某種已知蛋白質(zhì)的密碼子使用頻率，同時(shí)又采納了根據(jù)猜測(cè)最可能在目的基因中出現(xiàn)的密碼子資料，選擇含有密碼子簡(jiǎn)并程度最低的蛋白質(zhì)區(qū)段進(jìn)行合成。一種較長(zhǎng)的唯一的寡核苷酸序列，它能夠大范圍的卻不能夠完全的同靶序列互補(bǔ)。第十頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日第十一頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日PCR-猜測(cè)體探針（尿酸氧化酶基因）根據(jù)末端32個(gè)氨基酸序列，設(shè)計(jì)PCR簡(jiǎn)并引物，以cDNA為模板用猜測(cè)探針雜交篩選陽(yáng)性克隆第十二頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日應(yīng)用差別雜交或扣除雜交法分離克隆的目的基因第十三頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日差別雜交（differentialhybridization）又稱差別篩選(differentialscreening)

適用于分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達(dá)的mRNA的cDNA?？鄢s交（subtractivehybridization）又叫扣除cDNA克?。╯ubtractivecDNAcloning）通過(guò)構(gòu)建扣除文庫(kù)得以實(shí)現(xiàn)。第十四頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日差別雜交：需要兩種不同的細(xì)胞群體（目的基因正常表達(dá)、目的基因不表達(dá)），分別制備兩種不同mRNA提取物，以兩種總mRNA探針平行雜交，對(duì)有表達(dá)目的基因的細(xì)胞總mRNA構(gòu)建的克隆文庫(kù)進(jìn)行篩選。第十五頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日第十六頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日差別雜交的局限性：

1.雜交靈敏度低，對(duì)于低峰度的mRNA尤為明顯

2.工作量大，重復(fù)性差，兩套平行濾膜之間的DNA保有量有差別，導(dǎo)致雜交信號(hào)不一致。第十七頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

扣除雜交：去除普遍共同存在的、或是非誘發(fā)產(chǎn)生的cDNA序列，從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集。第十八頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日第十九頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)（DDRT-PCR）分離克隆的目的基因

(differentialdisplayreversetranscriptionpolymerasechainreaction)第二十頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日原理：用3’-端錨定引物和反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈；用3’-端錨定引物和5’-端10-mer隨機(jī)引物組成引物對(duì)，以反轉(zhuǎn)錄第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（DDRT-PCR），在標(biāo)準(zhǔn)的序列膠中電泳2~3小時(shí)，可顯示出50~100條長(zhǎng)度在100~5000bp之間的DNA條帶。第二十一頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

P.Liang等人設(shè)計(jì)合成了全部12種不同的引物，用以反轉(zhuǎn)錄mRNA，合成第一鏈cDNA。這種引物通常叫作3'-端錨定脫氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M為除了T以外的任何一種核苷酸（即A、G或C），而N則為任何一種核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12種不同的排列組合方式。mRNA:5’-NMAAAAAA…AA-3’(12種序列)3’-NMTTTTTTT…TT-5’3’-錨定引物：第二十二頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日第二十三頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日10-mer，更好的同第一鏈結(jié)合，從而呈現(xiàn)出更多種的mRNA。一般用20種隨機(jī)引物和12種3’-端錨定引物組成的全部240組引物對(duì)PCR擴(kuò)增后，所產(chǎn)生的大約20000條條帶，基本涵蓋了在一定的發(fā)育階段某種類型細(xì)胞中所表達(dá)的全部的mRNA。5’-隨機(jī)引物第二十四頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

由于在cDNA群體中，代表特定細(xì)胞類型或發(fā)育階段的mRNA的含量非常低，所以要把一種只在某一階段或某種細(xì)胞類型中表達(dá)、而在另一發(fā)育階段或某種細(xì)胞類型中不表達(dá)的目的基因分離出來(lái)，就需要PCR擴(kuò)增。DDRT-PCR第二十五頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日1.從一對(duì)處于不同發(fā)育階段（或不同基因型）的細(xì)胞群體中分離總mRNA，并用3’-端錨定引物作反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA;2.用5’-端隨機(jī)引物和3’-端錨定引物組成的引物對(duì)，在加入放射性同位素標(biāo)記的dNTP的條件下，以第一步反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

3.將擴(kuò)增樣品在變性的DNA測(cè)序膠中進(jìn)行電泳分離基本過(guò)程：第二十六頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日4.將有關(guān)的差別表達(dá)的DNA條帶從測(cè)序膠上切割下來(lái)回收其DNA片斷；5.膠塊中的DNA量非常少，不能用于克隆，需進(jìn)行二次擴(kuò)增；6.將克隆的特定的DNA分別同基因組DNA及總mRNA作Southern或Northern雜交，測(cè)序；7.以此目的片斷作探針從cDNA文庫(kù)中或基因組文庫(kù)中篩選全長(zhǎng)的cDNA克隆或基因組克隆。第二十七頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日第二十八頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日1.可以同時(shí)比較多個(gè)樣品表達(dá)的差異；

2.可以同時(shí)檢測(cè)“上游”及“下游”的基因；

3.檢測(cè)靈敏度高，所需樣品少，經(jīng)PCR擴(kuò)增一些低峰度的mRNA也可以被檢測(cè)出來(lái)；

4.結(jié)合使用了PCR和序列膠電泳分析兩項(xiàng)技術(shù)，使本方法顯得較單方便。優(yōu)點(diǎn)：第二十九頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

1.假陽(yáng)性比例高（50%～75%）；同一長(zhǎng)度的條帶，含有多種DNA序列；鄰近條帶回收時(shí)，造成人為誤差；mRNA3’-端序列保守性高，而常用3’-端cDNA作探針

2.擴(kuò)增的差別條帶分子長(zhǎng)度比較短?。?10～450bp）；

局限性：第三十頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

應(yīng)用表達(dá)文庫(kù)分離克隆的目的基因第三十一頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

當(dāng)沒(méi)有可用的核苷酸序列供作篩選基因文庫(kù)的探針時(shí)，將cDNA克隆在表達(dá)載體上，再導(dǎo)入大腸桿菌寄主細(xì)胞然后通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的鑒定，分離克隆的真核目的基因。表達(dá)文庫(kù)分離克隆的目的基因第三十二頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日1.表達(dá)的蛋白質(zhì)以融合蛋白質(zhì)的形式存在，其中原核蛋白質(zhì)的氨基酸序列是整合在真核蛋白質(zhì)的一個(gè)末端，不易被原核細(xì)胞中的有關(guān)蛋白酶消化降解，因而顯得比較穩(wěn)定，可以得到較高的表達(dá)水平。2.cDNA片斷必須置于啟動(dòng)子序列下游，在其控制之下；按正確的取向和讀碼結(jié)構(gòu)插入，確保產(chǎn)生正確的蛋白質(zhì)。特點(diǎn)：第三十三頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日1.利用抗體篩選表達(dá)文庫(kù)；

2.測(cè)定蛋白質(zhì)的功能；

3.用放射性同位素標(biāo)記的、帶有特定蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的DNA片斷作探針篩選表達(dá)文庫(kù)。篩選的方法：第三十四頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日將菌落或噬菌斑原位復(fù)制到膜上處理之后蛋白質(zhì)暴露，與第一抗體溫育漂洗未結(jié)合的抗體，加入經(jīng)標(biāo)記的第二抗體能與第一抗體結(jié)合抗體篩選表達(dá)文庫(kù)第三十五頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

生物化學(xué)研究表明，存在Ca＋＋離子的條件下，鈣調(diào)蛋白能與許多種酶結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物。將放射性同位素標(biāo)記得鈣調(diào)蛋白用作探針篩選cDNA表達(dá)文庫(kù)，鑒定能夠表達(dá)出與它特異性結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)的陽(yáng)性克隆。2.測(cè)定蛋白質(zhì)的功能第三十六頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

鑒定能夠表達(dá)出與特定DNA片斷（真核啟動(dòng)子中與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA元件）結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)的克隆。3.用放射性同位素標(biāo)記的、帶有特定蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的DNA片斷作探針篩選表達(dá)文庫(kù)第三十七頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日酵母雙雜交體系

（two-hybridsystem）第三十八頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

有效的分離能與已知的靶蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因。應(yīng)用于真核基因地表達(dá)調(diào)控，細(xì)胞粘合因子間的相互作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及細(xì)胞周期與分化、反式因子的鑒定與分離等研究酵母雙雜交體系又叫相互作用陷阱(interactiontrap)第三十九頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上可以分開(kāi)的、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成（example）；應(yīng)用重組DNA技術(shù)，也可以將來(lái)自同一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的、或者兩種不同轉(zhuǎn)錄因子的、分開(kāi)的兩種結(jié)構(gòu)域，在體內(nèi)重新組裝成具有功能的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活UAS（上游激活序列）下游啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的報(bào)告基因的表達(dá)?；驹恚旱谒氖?yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

釀酒酵母的半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4，在N端1～147位氨基酸區(qū)段有一個(gè)結(jié)合域（DNA-bindingdomain,DNA-BD）；在C端768～881位氨基酸區(qū)段有一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域（transcriptionactivationdomain,AD）DNA-BD能識(shí)別激活序列并與之結(jié)合；AD通過(guò)同轉(zhuǎn)錄機(jī)制中的其它成份之間的結(jié)合作用啟動(dòng)下游基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。用DNA重組技術(shù)將它們分開(kāi)，即使在同一個(gè)寄主中表達(dá)，也不會(huì)直接發(fā)生相互作用不能激活相關(guān)的效應(yīng)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。Example:第四十一頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日寄主菌株：剔除掉GAL4基因的釀酒酵母1.SFY526和HF7c帶有報(bào)告基因lacZ、HIS3和LEU22.還有兩種可以在大腸桿菌和酵母中自主復(fù)制的穿梭載體a.

pGBT9(DNA-BD)：靶基因是按正確的取向和讀碼結(jié)構(gòu)被克隆在載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)內(nèi)，于是靶蛋白和GAL4-BD之間產(chǎn)生融合作用，形成雜種蛋白質(zhì)b.第二種質(zhì)粒載體pGAD424(AD質(zhì)粒載體)用來(lái)構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫(kù)專用載體，克隆cDNA片斷是按正確的取向和讀碼結(jié)構(gòu)插入在載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)內(nèi)，因此由cDNA

編碼的蛋白質(zhì)便會(huì)同GSL4-AD之間產(chǎn)生融合作用，形成雜種蛋白質(zhì)。

第四十二頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日第四十三頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日第四十四頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日第四十五頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日選擇缺失GAL4編碼基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c；構(gòu)建帶有GAL1UAS-啟動(dòng)子-lacZ（His3）的轉(zhuǎn)化載體;把已知的靶蛋白質(zhì)編碼基因克隆到pGBT9的多克隆位點(diǎn)上，把所有cDNA都克隆到pGAD424載體上，構(gòu)成cDNA表達(dá)文庫(kù)。從大腸桿菌中分別提取這兩種重組質(zhì)粒DNA，共轉(zhuǎn)化感受態(tài)釀酒酵母菌株。

e.將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培養(yǎng)基上，篩選表達(dá)相互作用的雜種蛋白的陽(yáng)性菌落。酵母雙雜交體系的主要實(shí)驗(yàn)過(guò)程：go第四十六頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

1.遺傳檢測(cè)法

2.物理檢測(cè)法

3.菌落或噬菌斑雜交篩選法

4.免疫化學(xué)檢測(cè)法

5.蛋白質(zhì)篩選法

6.轉(zhuǎn)譯篩選法重組子分子的選擇與鑒定第四十七頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

重組子、目的重組子與非目的重組子由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子第四十八頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

該方法要求克隆基因能夠表達(dá)，并利用相應(yīng)的基因突變型作為受體細(xì)胞，當(dāng)受體細(xì)胞由突變型變?yōu)橐吧蜁r(shí)或賦予受體細(xì)胞特定的表型時(shí)，我們基本可以確定所克隆的基因是否是目的基因優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果較可靠缺點(diǎn)：基因必須表達(dá)并具有合適的受體細(xì)胞遺傳檢測(cè)法第四十九頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日1.根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子的直接選擇法

a.抗藥性記號(hào)插入失活選擇法

b.β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法第五十頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日第五十一頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日抗藥性篩選法的基本原理抗藥性篩選法可區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子將外源DNA片段插在EcoRI位點(diǎn)：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcr將外源DNA片段插在BamHI位點(diǎn)：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcs第五十二頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日抗藥性篩選法的基本操作：先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Ap的平板再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有Ap和Tc的平板上在Ap平板上生長(zhǎng)、但在Ap和Tc平板上不長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子即為重組子第五十三頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日顯色篩選法顯色篩選法的基本原理：

顯色篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì)胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認(rèn)和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ’基因（藍(lán)色反應(yīng)）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應(yīng)）等第五十四頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日顯色篩選法的基本操作

將外源基因克隆在pUC18的lacZ’標(biāo)記基因內(nèi)部，使之滅活，此時(shí)重組子呈Apr、lacZ-，淡黃色菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍(lán)色菌落第五十五頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日2.根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體分子的直接選擇法

轉(zhuǎn)化進(jìn)來(lái)的外源DNA編碼的基因，能夠?qū)Υ竽c桿菌寄主菌株所具有的突變體發(fā)生體內(nèi)抑制或互補(bǔ)效應(yīng)，從而使被轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征。第五十六頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日Example:

λgt.λB噬菌體（由于C片斷的缺失而造成重組缺陷的λred－噬菌體），在大腸桿菌ligts菌株上生長(zhǎng)不能形成噬菌斑，在有連接酶功能的大腸桿菌lig＋菌株上形成噬菌斑。將具有連接酶基因的重組體噬菌體λgt.λB，涂布在大腸桿菌ligts菌株上時(shí)，通過(guò)寄主細(xì)胞的互補(bǔ)作用，能夠形成噬菌斑。根據(jù)形成噬菌斑這種表型特征，直接選擇具野生功能的重組體噬菌體。

第五十七頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日缺點(diǎn)：不單要求克隆的DNA片斷必須大到括足以包含一個(gè)完整的基因，而且還要求所編碼的基因能夠在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)。（對(duì)于真核基因很難達(dá)到要求）第五十八頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日物理檢測(cè)法

1.凝膠電泳檢測(cè)法

利用凝膠電泳的方法，鑒定外源片斷是否插入及其長(zhǎng)度

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速

缺點(diǎn)：只能提供克隆片段大小的信息

第五十九頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日2.R-環(huán)檢測(cè)法：鑒定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源區(qū)域

在臨近雙鏈DNA變性溫度下和高濃度的甲酰胺溶液中（70%），雙鏈的DNA-RNA分子比雙鏈的DNA-DNA分子更加穩(wěn)定。在這種條件下，RNA會(huì)同它的雙鏈DNA分子中的互補(bǔ)序列退火形成穩(wěn)定的RNA-DNA，而被取代的另一條DNA呈單鏈狀態(tài)。這種由雙鏈RNA-DNA和單鏈DNA形成的泡狀體稱R-環(huán)結(jié)構(gòu)第六十頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日第六十一頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

包括菌落或噬菌斑的原位雜交技術(shù)

優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)便、快速。

缺點(diǎn)：必須具有相應(yīng)的探針。分子雜交技術(shù)檢測(cè)法第六十二頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

菌落或噬菌斑原位雜交法的工作原理是根據(jù)克隆的目的基因或DNA片段的同源序列設(shè)計(jì)并合成探針，以此搜尋篩選含有目的基因的目的重組子。其中，DNA同源序列之間的特異性互補(bǔ)雜交是該技術(shù)的基本理論依據(jù)第六十三頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日菌落原位雜交法的基本操作：用硝酸纖維素薄膜影印克隆平板用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜80℃烘干固定影印薄膜薄膜置于含有探針的雜交溶液中保溫用SSC-SDS液洗滌雜交薄膜用X光膠片覆蓋薄膜感光第六十四頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

利用免疫學(xué)的原理，檢測(cè)克隆基因的表達(dá)產(chǎn)物。免疫化學(xué)檢測(cè)法第六十五頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

該方法類似于原位雜交法優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)便，一次可檢測(cè)大量的克隆子缺點(diǎn)：克隆基因必須表達(dá)并具有相應(yīng)的抗體1.放射性抗體檢測(cè)法第六十六頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日1.免疫血清含有幾種IgG抗體，識(shí)別抗原分子上不同定子，并分別同各自識(shí)別的抗原定子相結(jié)合；

2.抗體分子或抗體的F（ab）部分，能夠牢固的吸附在固體基質(zhì)上（聚乙烯等塑料制品），而不容易被洗脫掉；

3.通過(guò)體外碘化作用，IgG抗體會(huì)迅速的被放射性同位素125I標(biāo)記上。

原理：第六十七頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日1.菌落溶解釋放出抗原蛋白質(zhì)；

a.把平板放置在氯仿蒸氣中；

b.用烈性噬菌體的氣溶膠噴灑；

c.用帶有能被熱誘發(fā)的原噬菌體的寄主菌處理。2.將連結(jié)在固體支持物上的抗體緩慢的同溶解的細(xì)胞接觸，形成抗原－抗體復(fù)合物3.將固體支持物取出，與放射性標(biāo)記的第二種抗體溫育；4.放射自顯影檢測(cè)。步驟：第六十八頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日用氯仿蒸汽或烈性噬菌體噴灑克隆平板用固定了特異性抗體的聚乙烯薄膜影印裂解平板輕輕漂洗影印薄膜，干燥固定與II125標(biāo)記的IgG保溫洗滌、干燥、感光放射免疫原位雜交鑒定第六十九頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日細(xì)菌菌落溶解，釋放出抗原蛋白質(zhì)第七十頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日雙位點(diǎn)檢測(cè)法：適用于含有雜種多肽菌落分析。雜種多肽A–B

（A）抗體（B）抗體固定在固體基質(zhì)125I標(biāo)記第七十一頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日濾膜抗體溶液放射性標(biāo)記抗體檢測(cè)法的操作程序聚乙烯薄膜培養(yǎng)皿及菌落放射性標(biāo)記抗體檢測(cè)法的操作程序第七十二頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

在生長(zhǎng)菌落的瓊脂培養(yǎng)基中，加入專門抗這種蛋白質(zhì)分子的特異性抗體。如果菌落的細(xì)菌會(huì)分泌出某種蛋白質(zhì)，那么它的周圍，就會(huì)出現(xiàn)一條由一種叫做沉淀素的抗體-抗原沉淀物所形成的白色的圓圈

靈敏度低，易受干擾，實(shí)用性差。

2.免疫沉淀檢測(cè)法第七十三頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日免疫沉淀鑒定：第七十四頁(yè)，共八十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日

用專門設(shè)計(jì)的表達(dá)載體，將真核基因編碼的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，通過(guò)免疫化學(xué)法進(jìn)行檢測(cè)。

3.表達(dá)