干細(xì)胞基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究演示文稿當(dāng)前1頁，總共53頁。內(nèi)容安排一、理論課1、細(xì)胞體外培養(yǎng)基本技術(shù)和方法討論2、干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)3、胚胎干細(xì)胞4、成體（組織）干細(xì)胞5、討論交流二、實驗課1、干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與觀察三、考核內(nèi)容：設(shè)計一份完整的“XX干細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法（流程）”時間：2014年1月干細(xì)胞基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究當(dāng)前2頁，總共53頁。干細(xì)胞基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究（一）

細(xì)胞體外培養(yǎng)

基本技術(shù)和策略討論當(dāng)前3頁，總共53頁。（一）基本概念1體外培養(yǎng)(Invitroculture)對象：細(xì)胞（特定條件下、單一細(xì)胞成份）組織器官胚胎（全胚培養(yǎng)Holo-embryoculture）條件：體內(nèi)生存環(huán)境的模擬（天然優(yōu)化環(huán)境～人工環(huán)境）目的：1、建立活體結(jié)構(gòu)成分在體外生存、生長的適宜環(huán)境

2、應(yīng)用當(dāng)前4頁，總共53頁。（一）基本概念2體內(nèi)培養(yǎng)(Invivoculture)方式：移植（Transplantation）條件：異體相似環(huán)境優(yōu)點：最大限度模擬自然生長環(huán)境目的：分化研究、臨床治療、特殊目的（如珍貴細(xì)胞株污染的處理）當(dāng)前5頁，總共53頁。（二）基本條件（模擬）營養(yǎng)條件的模擬

水：無機(jī)鹽：葡萄糖：維生素：氨基酸：細(xì)胞因子(Cytokine)：未知因素理化條件的模擬溫度：液體滲透壓：氧與酸堿度：細(xì)胞之間的相互關(guān)系：培養(yǎng)基的選擇當(dāng)前6頁，總共53頁。一、水細(xì)胞及機(jī)體內(nèi)環(huán)境～溶解或分散狀態(tài)離子和/或分子的水溶液（化學(xué)基礎(chǔ)）水的重要性質(zhì)：惰性～大多數(shù)物質(zhì)溶于水而不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。熱穩(wěn)定性和導(dǎo)熱性。表面張力等等：表面張力是維持細(xì)胞形態(tài)的重要條件。當(dāng)前7頁，總共53頁。二、無機(jī)鹽存在形式：離子狀態(tài)為主結(jié)合（蛋白質(zhì)或脂質(zhì)）形成與維持培養(yǎng)液的晶體滲透壓對細(xì)胞功能活動的支持作用細(xì)胞和組織類型不同，對無機(jī)鹽的要求也不同實驗?zāi)康牟煌?，對培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的要求也不同實驗步驟的目的不同，對培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的要求也不同當(dāng)前8頁，總共53頁。三、理化條件1溫度：35～37℃細(xì)胞對低溫耐受能力強(qiáng)過高溫

1、應(yīng)該對實驗有全過程的考慮

2、高溫的結(jié)果是一樣的

3、低溫條件下細(xì)胞活動減緩至停止

4、對低溫的耐受能力與細(xì)胞類型、個體年齡等因素有關(guān)

5、低溫的危害與細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成的不均衡有關(guān)，故降溫應(yīng)該是緩慢的，避免冰晶形成；復(fù)溫應(yīng)該是快速的。液體滲透壓：正常血漿280～310mOsm/kg；（主要由晶體滲透壓構(gòu)成膠體滲透壓〈1.5mOsm/kg）酸堿度：7.36～7.44耐受范圍6.0～8.0；當(dāng)前9頁，總共53頁。三、理化條件2細(xì)胞之間的相互關(guān)系：1、從組織水平的認(rèn)識細(xì)胞是結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，而組織是細(xì)胞的存在形式。2、從細(xì)胞水平的認(rèn)識

a.直接接觸型；膜表面分子結(jié)合

b.直接聯(lián)系型；胞間間隙連接

c.間接聯(lián)系型；生物因子傳遞當(dāng)前10頁，總共53頁。三、理化條件3生長基質(zhì)（Groundsubstance）：大多數(shù)機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞不是生活在液態(tài)環(huán)境中的，體外培養(yǎng)環(huán)境下表現(xiàn)為貼壁、附壁生長，培養(yǎng)器皿的表面不適合細(xì)胞的這一特性，必需包被某些物質(zhì)，以幫助細(xì)胞貼壁、附壁生長。

1、多聚賴氨酸(Polylysine)0.05mg/ml2、纖維連接蛋白(Fibronectin)3、膠原（如鼠尾膠）

4、層粘連蛋白(Laminin)5～10μg/ml當(dāng)前11頁，總共53頁。四、培養(yǎng)基的選擇1一、基本概念培養(yǎng)基(Nutrientmedium)：多指商品，固態(tài)或粉劑，未經(jīng)溶劑溶解的狀態(tài)。培養(yǎng)液(Culturesolutionmedium)：用溶劑溶解后的溶液，一般添加有血清、抗生素、活性因子等等。條件培養(yǎng)液(Conditionedmedium)：經(jīng)過某些細(xì)胞培養(yǎng)，含有特定的（已知或未知）細(xì)胞分泌物的培養(yǎng)液。參考文獻(xiàn)只能提供基本的參考，除重復(fù)性實驗外，具體的實驗方案應(yīng)該從多個角度來綜合考慮，必要時還應(yīng)該做探索性實驗。當(dāng)前12頁，總共53頁。二、常用類型天然培養(yǎng)基：血清、胚胎滲出液、水解蛋白合成培養(yǎng)基：RPMI1640、EagleMEM系列（BME、DMEM、IMEM、αMEM）、HamF12。無血清培養(yǎng)基：化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，對實驗?zāi)康暮图?xì)胞類型的針對性強(qiáng)。

1、基礎(chǔ)培養(yǎng)液：DMEM∶HamF12=1∶12、附加成分：根據(jù)實驗?zāi)康?、?xì)胞類型等因素設(shè)定。如B27、N-2，針對神經(jīng)元；G-5，針對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞四、培養(yǎng)基的選擇2當(dāng)前13頁，總共53頁。（三）基本步驟

取材：目的明確、取材準(zhǔn)確、避免過多的損失和損傷。分離:制作細(xì)胞懸液。純化：提高目的細(xì)胞富集度。原代培養(yǎng)：目的細(xì)胞在體外條件下的生長、擴(kuò)增。傳代培養(yǎng)：進(jìn)一步擴(kuò)增、純化。鑒定：定質(zhì)、定量。凍存與復(fù)蘇：保存

連續(xù)傳代培養(yǎng)當(dāng)前14頁，總共53頁。一、取材1（一）、實驗的目的：

直接影響實驗各環(huán)節(jié)，如培養(yǎng)基的選擇、培養(yǎng)時間的長短等等。

取材是整個實驗的重要步驟之一，決定了后續(xù)實驗步驟的效率。當(dāng)前15頁，總共53頁。一、取材2（二）、細(xì)胞及其所在組織的性質(zhì)：幫助確定分離的方法、消化酶的選擇與使用等等。（三）、操作流程的優(yōu)化：

應(yīng)該充分考慮保持細(xì)胞活力：操作時間短、細(xì)胞損失和損傷少。當(dāng)前16頁，總共53頁。一、取材3細(xì)胞懸液(Cellsuspension)：單個細(xì)胞存在于溶液（培養(yǎng)液、平衡液、緩沖液等）。一般程序：１、解剖充分暴露、洗滌、剔除多余組織。２、分割1mm3植塊植塊培養(yǎng)３、分離（散）細(xì)胞機(jī)械解離、酶消化、鰲合劑解離。４、篩網(wǎng)過濾５、低速離心500～800r／m

5～10min

800～1000r／m

5～10min６、計數(shù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞密度105個／ml

當(dāng)前17頁，總共53頁。二、分離與純化1分離與純化在概念上沒有明確的區(qū)別，也不是一個單一的、獨立的步驟，往往貫穿在整個細(xì)胞培養(yǎng)的過程之中。分離與純化是衡量細(xì)胞培養(yǎng)成功與否的重要標(biāo)志；也是建立細(xì)胞系（細(xì)胞株）的前提。1、細(xì)胞分離（Separation）：從組織材料、細(xì)胞懸液中獲取目的細(xì)胞。2、細(xì)胞純化（Purification）：從異質(zhì)性的混合物中獲得單一類型細(xì)胞。3、富集（Enrichment）：分離純化后，目的細(xì)胞數(shù)量所達(dá)到的比例。當(dāng)前18頁，總共53頁。二、分離與純化2（一）基本原理1、根據(jù)細(xì)胞的物理特性，如密度、電荷等。2、根據(jù)細(xì)胞的生物學(xué)特性，如貼壁緊密程度、貼壁快慢、特異性表面標(biāo)志等。3、根據(jù)其它細(xì)胞特性（二）基本方法1、機(jī)械分離與酶學(xué)分離2、基于物理性狀的分離純化技術(shù)、速度沉降法3、根據(jù)細(xì)胞表面電荷的分離方法4、利用細(xì)胞表面標(biāo)志的分離方法5、根據(jù)其它細(xì)胞特性的分離方法當(dāng)前19頁，總共53頁。機(jī)械分離與酶學(xué)分離11、取材過程中的分離

盡可能剔除其它結(jié)構(gòu)、組織。充分沖洗，必要時可考慮添加抗生素。2、篩網(wǎng)過濾根據(jù)組織、細(xì)胞的類型，細(xì)胞大小來選擇篩網(wǎng)的材質(zhì)、孔徑大小3、酶學(xué)分離對同一種組織，采用不同的酶消化，細(xì)胞富集的類型也不同。舉例：對皮膚消化胰蛋白酶？膠原酶？當(dāng)前20頁，總共53頁。機(jī)械分離與酶學(xué)分離24、培養(yǎng)過程中的選擇性體外培養(yǎng)過程中的自然法則：

a、富集多、活力強(qiáng)、增殖能力強(qiáng)的細(xì)胞類型會表現(xiàn)出優(yōu)勢生長。

b、細(xì)胞集落可以出現(xiàn)區(qū)域性分布。方法：機(jī)械性刮除、選擇性消化目的：清除或收集當(dāng)前21頁，總共53頁?；谖锢硇誀畹姆蛛x純化技術(shù)1優(yōu)點：無需對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)雜的（化學(xué)、生物學(xué)等）處理，避免了細(xì)胞發(fā)生變化，對細(xì)胞的活力影響較少。關(guān)鍵：1、密度梯度形成介質(zhì)的選擇。

2、密度梯度的配置。也稱為密度梯度離心（Densitygradientcentrifugation）技術(shù)沉降速度=離心力細(xì)胞體積細(xì)胞密度和介質(zhì)密度差/介質(zhì)黏度當(dāng)前22頁，總共53頁。介質(zhì)選擇的原則：

1、密度范圍大包括所需要的密度。

2、溶液的黏度低較小離心力和較短離心時間可達(dá)到分離效果

3、易于測定其密度（濃度）。

4、不損傷細(xì)胞、不改變細(xì)胞生物學(xué)特性。

5、離心分離后易于除去。

6、不妨礙、不影響后續(xù)實驗研究的目的?；谖锢硇誀畹姆蛛x純化技術(shù)2當(dāng)前23頁，總共53頁?；谖锢硇螤畹姆蛛x純化技術(shù)3

常用介質(zhì)1、血清白蛋白早期常用，但黏度太高。2、聚蔗糖（Polysucrose）即Ficoll，實驗室常見，缺點是：黏度、滲透毒性隨濃度增加而增加。使用時注意避免。3、泛影酸鹽常用的“淋巴細(xì)胞分離液（密度：1.077±0.001g/ml）”就是泛影酸鹽和Ficoll配制而成，以避免Ficoll黏度、滲透毒性隨濃度增加而增加的缺點。當(dāng)前24頁，總共53頁?；谖锢硇螤畹姆蛛x純化技術(shù)4

常用介質(zhì)4、硅膠顆粒Percoll（密度：1.13±0.005g/ml）

優(yōu)點：（1）穩(wěn)定性好。可長期保存。（2）密度稀釋范圍大，包括了大多數(shù)細(xì)胞密度。（3）溶液產(chǎn)生的滲透壓小，全密度范圍內(nèi)維持等張。（4）黏度低，較小離心力和較短離心時間可達(dá)到分離效果。（5）易于洗滌清除，對細(xì)胞無毒性。（6）高速離心時可形成連續(xù)密度剃度。（10000r/min）（7）用量少，經(jīng)濟(jì)。當(dāng)前25頁，總共53頁?；谖锢硇螤畹姆蛛x純化技術(shù)5

常用方法1、一步密度梯度離心法高密度介質(zhì)、低速離心依據(jù)細(xì)胞的密度和體積:密度大于介質(zhì)的在介質(zhì)之下；密度小于介質(zhì)的在介質(zhì)之上體積大的沉降速度快；體積小的沉降速度慢。注意：對不同物種的細(xì)胞，分離介質(zhì)的密度稍有不同。當(dāng)前26頁，總共53頁?；谖锢硇螤畹姆蛛x純化技術(shù)6

常用方法2、等密度梯度離心法依據(jù)細(xì)胞的密度

a、連續(xù)密度梯度：密度逐漸增高的介質(zhì)體系

ρc=ρm時，沉降速度為零，細(xì)胞停留在密度相同的介質(zhì)區(qū)帶內(nèi)。

b、不連續(xù)密度梯度：密度遞減、順序、分層分布介質(zhì)體系，時細(xì)胞停留在

ρm1〉

ρc〉ρm2的界面上。當(dāng)前27頁，總共53頁?；谖锢硇螤畹姆蛛x純化技術(shù)7

常用方法3、速度沉降法依據(jù)細(xì)胞的密度和體積，但以體積為主要因素。

a、單位重力速度沉降法：單位重力作用，低密度介質(zhì)（BSA+0.01mol/LPBS，梯度：1.0099～1.0123g/ml）優(yōu)點：細(xì)胞回收率高、重復(fù)性好、分離量大。缺點：時間太長（數(shù)個小時?。。。?，細(xì)胞活力易受影響。

b、低速離心速度沉降法：

5%～20%Ficoll，100g，25min的條件下。當(dāng)前28頁，總共53頁。根據(jù)其它細(xì)胞特性的分離方法1一、反復(fù)植塊培養(yǎng)法原理：不同的細(xì)胞從植塊中遷移出來的時間、速度不同。優(yōu)點：細(xì)胞在取材時受損傷少缺點：純化周期長，細(xì)胞純度低，細(xì)胞產(chǎn)量低。植塊雪旺細(xì)胞成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞第一周第二周第三周當(dāng)前29頁，總共53頁。根據(jù)其它細(xì)胞特性的分離方法2二、有絲分裂抑制劑法原理：有絲分裂后細(xì)胞（不再分裂增殖的細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞）不受有絲分裂抑制劑的影響，可分裂細(xì)胞明顯受其抑制逐漸消亡。常用抑制劑：

阿糖胞苷（Ara-C）、氟尿嘧啶（FU）當(dāng)前30頁，總共53頁。三、原代培養(yǎng)1原代培養(yǎng)的概念：1、是指“初次培養(yǎng)”的含義，沒有培養(yǎng)物的分割。2、“代”只是分割的記錄與記數(shù)形式，與細(xì)胞分裂增殖的“代”不同。3、植塊培養(yǎng)也可以分割，故也可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)4、更換培養(yǎng)液、更換培養(yǎng)器皿，仍是原代培養(yǎng)。當(dāng)前31頁，總共53頁。三、原代培養(yǎng)2基本目的：1、維持目的細(xì)胞在體外條件下生存一段時間,適應(yīng)體外培養(yǎng)的新環(huán)境。2、更接近原來的組織形式，有利于目的細(xì)胞適應(yīng)體外培養(yǎng)的新環(huán)境。3、使目的細(xì)胞在體外條件下穩(wěn)定生長、擴(kuò)增，形成優(yōu)勢群體。當(dāng)前32頁，總共53頁。三、原代培養(yǎng)3植塊培養(yǎng)植塊培養(yǎng)目的：1、觀察組織生長行為及其規(guī)律。2、獲得向外遷移的細(xì)胞（應(yīng)該有相應(yīng)的松解、離散措施）。植塊培養(yǎng)的優(yōu)點：保持了良好的3D組織結(jié)構(gòu)、維持了細(xì)胞之間的相互作用，細(xì)胞易于成活和生長。植塊培養(yǎng)的缺陷：植塊中央的物質(zhì)交換受局限。適宜大小！1mm3植塊培養(yǎng)的關(guān)鍵：1、植塊的貼壁、固定。2、培養(yǎng)液的添加。3、如果是為了獲得細(xì)胞，要注意植塊的適時移出。當(dāng)前33頁，總共53頁。三、原代培養(yǎng)4細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)點：能在特定條件下，獲得單一類型的細(xì)胞并進(jìn)行相關(guān)的研究。關(guān)鍵：使細(xì)胞盡快進(jìn)入分裂、增殖的生長狀態(tài)。

1、促進(jìn)細(xì)胞貼壁

2、適宜的細(xì)胞接種密度。

105個/ml是常用的標(biāo)準(zhǔn)，但還應(yīng)該考慮細(xì)胞類型、生長能力、活力。

干細(xì)胞的培養(yǎng)會選擇更低密度？當(dāng)前34頁，總共53頁。三、原代培養(yǎng)5培養(yǎng)空間3、培養(yǎng)空間構(gòu)建適宜的培養(yǎng)體系：培養(yǎng)體系由兩大部分組成：液相和氣相調(diào)整培養(yǎng)空間的目的：保證細(xì)胞的供O2量相關(guān)參數(shù)：（1）、液相∶氣相=1∶10（體積）（2）、液相高度：2～5mmO2O2O2當(dāng)前35頁，總共53頁。四、傳代培養(yǎng)1傳代的目的：1、避免接觸性抑制，保持細(xì)胞穩(wěn)定地生長。2、進(jìn)一步純化細(xì)胞類型。（1）不同的傳代處理方式（2）不同的處理強(qiáng)度傳代的指標(biāo)：1、體細(xì)胞：集落占據(jù)80%～90%的瓶底面積。2、干細(xì)胞：根據(jù)目的細(xì)胞集落的生長狀況，有必要時。當(dāng)前36頁，總共53頁。四、傳代培養(yǎng)2傳代的基本步驟：1、換液一些技術(shù)手冊要求傳代前一天換液，主要是改善細(xì)胞狀態(tài)，增強(qiáng)適應(yīng)能力。2、解離細(xì)胞目的細(xì)胞的生物學(xué)特性決定解離細(xì)胞方法酶消化法機(jī)械震蕩法3、再次接種傳代的關(guān)鍵：1、適當(dāng)?shù)臅r間2、適當(dāng)?shù)姆椒?、適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度當(dāng)前37頁，總共53頁。五、“二倍體細(xì)胞”的問題細(xì)胞性狀的穩(wěn)定，是體外培養(yǎng)條件下，研究體內(nèi)細(xì)胞生物學(xué)性狀的前提。問題：在較長時間和不適宜條件下的體外培養(yǎng)，由于細(xì)胞融合等已知和未知的原因，細(xì)胞的染色體倍數(shù)會發(fā)生變化，成為多倍體細(xì)胞。營養(yǎng)條件理化條件生活環(huán)境遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)傳代當(dāng)前38頁，總共53頁。六、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長與觀察1

在體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長行為會有相應(yīng)的變化，對其研究的目的是：

1、了解細(xì)胞的生長行為的基本規(guī)律；

2、區(qū)分質(zhì)變與量變，判斷目的細(xì)胞的價值和意義。A、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式：

1、黏附型

2、懸浮型當(dāng)前39頁，總共53頁。六、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長與觀察2黏附型細(xì)胞黏附是體外培養(yǎng)條件下恢復(fù)“組織形式”的傾向

1、細(xì)胞與細(xì)胞之間的接觸

2、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合體內(nèi)、體外的差異：體內(nèi)是立體三維的結(jié)構(gòu)；而體外只是二維的空間，大多數(shù)情況下只有一個附著面。故細(xì)胞的外形會有變化。當(dāng)前40頁，總共53頁。六、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長與觀察3黏附型細(xì)胞的類型：1、上皮型細(xì)胞（上皮樣細(xì)胞）：細(xì)胞鑲嵌狀緊密排列，呈“鋪路石樣”；起源于內(nèi)胚層、外胚層的細(xì)胞多呈此型。當(dāng)前41頁，總共53頁。六、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長與觀察42、成纖維細(xì)胞（成纖維細(xì)胞樣）：細(xì)胞梭形、多角形、胞體鋪展，細(xì)胞間隙較大，細(xì)胞排列疏松；細(xì)胞可呈放射狀、螺旋狀排列。起源于中胚層的細(xì)胞多成此型。當(dāng)前42頁，總共53頁。六、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長與觀察53、多形型細(xì)胞細(xì)胞有較長的突起、胞體多角形，可分為胞體部和突起部，細(xì)胞間距大。常見類型：神經(jīng)組織細(xì)胞。當(dāng)前43頁，總共53頁。六、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長與觀察64、游走型細(xì)胞：細(xì)胞分散、不易形成集落；可有胞質(zhì)突起，細(xì)胞變形、游走活躍。見于單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)、腫瘤細(xì)胞。當(dāng)前44頁，總共53頁。六、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長與觀察7鋪展：球形原餅形

細(xì)胞鋪展

極性細(xì)胞鋪展的程度與細(xì)胞DNA合成、細(xì)胞的生長有密切關(guān)系。內(nèi)質(zhì)外質(zhì)當(dāng)前45頁，總共53頁。六、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長與觀察9B、每一代細(xì)胞的生長過程：1、潛伏期：2、指數(shù)生長期：3、停滯期：123接種細(xì)胞數(shù)量培養(yǎng)時間當(dāng)前46頁，總共53頁。關(guān)于“隔天換液”的辨析：細(xì)胞周期（cellcycle)：

是指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程，分為間期與分裂期兩個階段根據(jù)細(xì)胞的分裂能力可把它們分為三類：①增殖細(xì)胞群，如造血干細(xì)胞，表皮與胃腸粘膜上皮的干細(xì)胞。這類細(xì)胞始終保持活躍的分裂能力，連續(xù)進(jìn)入細(xì)胞周期循環(huán)