-.z基于納米材料新型電化學傳感器的制備及其在生物樣品分析中的應用研究【摘要】：電化學生物傳感器結合了信息技術與生物技術,涉及化學、生物學、物理學以及電子學等學科。由于其具有體積小、分辨率高、響應時間短、所需樣品少、對活細胞損傷小等特點,電化學生物傳感器在醫(yī)藥工業(yè)、食品檢測和環(huán)境保護等諸多領域有著廣闊的應用前景。近年來,隨著材料科學、化學、物理學等學科的開展,納米材料因具有特殊的構造效應,如小尺寸效應、外表界面效應、量子尺寸效應、宏觀量子隧道效應及介電限域效應等,使其在許多領域得到了廣泛應用。目前,采用納米材料構建新型的電化學生物傳感器日益成為研究熱點。納米材料應用于電化學生物傳感器領域后,不僅提高了傳感器的檢測性能,而且使傳感器的化學和物理性質以及它對生物分子或者細胞的檢測靈敏度大幅提高,檢測時間也得以縮短,并且可實現(xiàn)高通量的實時分析檢測。本論文的工作主要集中在將納米技術和電化學傳感技術相結合,開發(fā)了基于納米材料的新型電化學生物傳感器并將其用于檢測水體中大腸桿菌和細胞外表的多聚糖。該傳感技術為水體中大腸桿菌的快速檢測提供了新方法,同時也為腫瘤疾病的早期診斷及治療提供了新途徑。具體研究內容如下：第一局部：CuAu復合納米粒子標記抗體的電化學免疫方法用于水體中大腸桿菌的快速檢測本文制備了CuAu復合納米粒子,并將其用于標記大腸桿菌抗體,利用電化學免疫技術實現(xiàn)了對水體中大腸桿菌的快速檢測。CuAu復合納米粒子具有優(yōu)良的生物相容性、電化學活性和穩(wěn)定性。與單獨的金納米顆粒相比,CuAu復合納米粒子作為抗體標記物大幅提高了電化學檢測的靈敏度。在實驗過程中,首先將大腸桿菌吸附在聚苯乙烯修飾的ITO導電玻璃外表,利用抗體和大腸桿菌之間的免疫反響把CuAu復合納米粒子標記的抗體結合在ITO導電玻璃外表。將CuAu復合納米粒子在溴氫酸中氧化為離子形式,然后用陽極溶出伏安法定量檢測溶液中的Cu2+。為了提高檢測靈敏度,采用Nafion/汞膜修飾的玻碳電極(GCE/Nafion/Hg)作為工作電極,Cu2+的檢測限可達9.0×10-12M。結果說明,在50cfu/mL～5.0×104cfu/mL濃度*圍內,銅的響應電流與大腸桿菌濃度的對數(shù)呈線性關系,檢測限為30cfu/mL,總的分析時間為2h。將研究的電化學免疫方法用于地表水中大腸桿菌的測定,通過對實際水樣進展預富集,能夠檢測到大腸桿菌的濃度為3cfu/10mL。第二局部：基于磁性高分子微球的電化學DNA生物傳感器用于水體中大腸桿菌的檢測本文研制了一種新型的基于磁性高分子微球的電化學DNA生物傳感器,并將其用于水體中大腸桿菌的檢測。以海藻酸包裹鈷的磁性高分子微球作為DNA探針的固體基質,根據(jù)大腸桿菌細胞體內uidA基因合成了特異性的DNA序列,制備了用于大腸桿菌檢測的DNA探針。利用透射電鏡技術對制備的磁性高分子微球進展了表征,并通過紅外光譜法證實了特定DNA序列與磁性高分子微球的成功連接。在DNA雜交前后,分別對嵌入式雜交指示劑柔紅霉素進展電化學測定,根據(jù)電化學信號的變化對目標DNA進展檢測。采用非互補DNA序列、三個堿基錯配的DNA序列及完全互補DNA序列驗證了DNA探針的選擇性。實驗過程中利用聚合酶鏈反響(PCR)技術提取了大腸桿菌細胞體內uidA基因片斷,并用電化學DNA生物傳感器對經過熱處理后的PCR產物和水體中大腸桿菌進展了測定。結果說明,本文研制的電化學DNA生物傳感器可以檢測到0.30nM完全互補DNA序列和0.50ng/μL的PCR產物,對大腸桿菌的檢出限為50cfu/mL。第三局部：基于二茂鐵修飾氧化鋅納米棒的信號放大策略用于水體中大腸桿菌的電化學免疫檢測本文將大腸桿菌檢測抗體(dAb)和二茂鐵(Fc)共同修飾于氧化鋅納米棒(ZnONRs)外表制備了{dAb-ZnO-Fc}生物復合物,并將其用于水體中大腸桿菌的電化學免疫檢測。采用BCA蛋白測定法(BCAproteinassay)和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)分別對檢測抗體和二茂鐵在氧化鋅納米棒上的最優(yōu)配比進展了研究。該生物復合物利用二茂鐵作為電活性物質產生電信號,檢測抗體用于免疫結合大腸桿菌。采用“**治〞夾心構造,首先將捕獲抗體固定在巰基乙酸修飾的金電極外表,然后通過免疫反響結合大腸桿菌,進而吸附{dAb-ZnO-Fc}生物復合物,最后用示差脈沖伏安法測定固定在電極外表上的二茂鐵。通過分析檢測不同濃度大腸桿菌溶液獲得的電流信號,從而實現(xiàn)了對大腸桿菌的定量檢測。實驗結果說明,在1.0×102cfu/ML～1.0×106cfu/mL濃度*圍內,二茂鐵的電流信號與大腸桿菌濃度的對數(shù)呈線性關系,檢出限為50cfu/mL。通過對實際水樣進展富集濃縮,該電化學免疫技術可以檢測到5cfu/10mL大腸桿菌。第四局部：巰基糖衍生物功能化的電化學生物傳感器用于活體腫瘤細胞外表多聚糖的競爭檢測本文合成了巰基糖衍生物用于構建電化學生物傳感器,采用競爭策略檢測活體腫瘤細胞外表多聚糖的表達水平。該傳感器利用納米金/碳納米管修飾玻碳電極(GCE/MWNT/AuNP)為基底,通過Au-S鍵固定巰基糖衍生物。此外,采用碳納米管為載體固定辣根過氧化酶(HRP)和刀豆球蛋白(ConA)制備了{ConA-MWNT-HRP}生物復合物。以人體肺、肝、前列腺組織中活體腫瘤細胞外表甘露糖為研究對象,利用甘露糖和刀豆球蛋白的特異性結合,傳感器外表的巰基糖衍生物與細胞外表的甘露糖競爭結合{ConA-MWNT-HRP}生物復合物。以對苯二酚為電子媒介體,通過測定辣根過氧化酶催化過氧化氫產生的響應電流對活細胞外表的多聚糖進展檢測。結果說明,在優(yōu)化的實驗條件下,本方法用于腫瘤細胞的定量檢測具有寬的線性*圍和低的檢測限。同時,我們計算了每個細胞外表甘露糖的數(shù)目：每個肺癌細胞A549含有甘露糖的數(shù)目為5.8×1010個,每個肝癌細胞QGY-7703含有甘露糖的數(shù)目為1.3×1010個,每個前列腺癌細胞LNCaP含有甘露糖的數(shù)目為1.9×1010個。本文所研制的巰基糖衍生物功能化的電化學生物傳感器用于甘露糖的測定具有靈敏度高、選擇性好、響應信號快等優(yōu)點,為活細胞外表多聚糖的檢測提供了新的方法。第五局部：凝集素電化學生物傳感器用于活體腫瘤細胞外表多聚糖的檢測研究本文制備了一種高靈敏度和高選擇性的凝集素(lectins)生物傳感器并將其用于檢測甘露糖(mannose)和唾液酸(sialicacid)在人體肺、肝、前列腺組織中正常細胞和腫瘤細胞外表的表達水平。采用碳納米管/納米金(MWNT/AuNP)修飾電極固定凝集素,利用細胞外表的多聚糖(glycans)和凝集素之間的特異性相互作用將細胞吸附在傳感器外表,然后結合硫堇(Th)包被金納米粒子標記的凝集素{lectin-Au-Th}構建“**治〞夾心構造。最后用示差脈沖伏安法(DPV)定量檢測硫堇,實現(xiàn)了對細胞外表多聚糖的測定。實驗結果說明,甘露糖在正常細胞和腫瘤細胞外表的表達水平普遍較高；唾液酸在腫瘤細胞外表的表達水平要明顯高于其在正常細胞外表的表達,研究結果對于提醒腫瘤細胞的生物學行為具有一定的指導意義。同時,依據(jù)腫瘤細胞外表唾液酸與接骨木凝集素(SNA)的特異性相互作用,將該電化學生物傳感器定量檢測了人體肺、肝、前列腺組織中的腫瘤細胞和每個腫瘤細胞外表唾液酸的含量并獲得了滿意的結果。本方法具有靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點,在腫瘤疾病的早期診斷中具有很好的應用前景?！娟P鍵詞】：電化學生物傳感器納米材料大腸桿菌多聚糖

【學位授予單位】：華東師*大學

【學位級別】：博士

【學位授予年份】：2011

【】：TP212.2

【目錄】：論文摘要6-10ABSTRACT10-18第一章緒論18-47第一節(jié)電化學生物傳感器19-26第二節(jié)納米材料及其在電化學生物傳感器中的應用26-34第三節(jié)大腸桿菌和細胞外表多聚糖的檢測意義34-36第四節(jié)本論文的主要研究內容36-38參考文獻38-47第二章CuAu復合納米粒子標記抗體的電化學免疫方法用于水體中大腸桿菌的快速檢測47-581.引言47-482.實驗局部48-502.1試劑與儀器48-492.2平板計數(shù)法492.3CuAu復合納米粒子的制備及大腸桿菌抗體的標記49-502.4免疫檢測過程503.結果與討論50-553.1CuAu復合納米粒子的表征50-513.2電化學免疫方法的檢測機理51-523.3免疫反響條件的優(yōu)化52-533.4CuAu復合納米粒子的氧化和Cu~(2+)的電化學檢測條件優(yōu)化533.5電化學免疫技術檢測大腸桿菌53-543.6其它細菌的干擾實驗54-553.7地表水中大腸桿菌的檢測554.結論55參考文獻55-58第三章基于磁性高分子微球的電化學DNA生物傳感器用于水體中大腸桿菌的檢測58-691.引言58-602.實驗局部60-622.1試劑與儀器60-612.2磁性高分子微球的制備612.3DNA探針的制備612.4大腸桿菌特異性uidA基因片斷提取61-622.5大腸桿菌的電化學檢測623.結果與討論62-663.1磁性高分子微球及DNA探針的表征62-633.2DNA電化學檢測機理63-643.3DNA雜交條件的優(yōu)化64-653.4DNA探針的選擇性研究65-663.5DNA探針用于特定DNA序列的電化學定量檢測664.結論66-67參考文獻67-69第四章基于二茂鐵修飾氧化鋅納米棒的信號放大策略用于水體中大腸桿菌的電化學免疫檢測69-841.引言69-702.實驗局部70-722.1試劑與儀器70-712.2大腸桿菌的培養(yǎng)與平板計數(shù)法712.3{_dAb-ZnO-Fc}生物復合物的制備71-722.4免疫傳感器的制備722.5大腸桿菌的檢測723.結果與討論72-813.1氧化鋅納米棒修飾氨基前后的表征72-733.2電化學免疫方法的檢測原理73-743.3免疫傳感器的電化學表征74-753.4{_dAb-ZnO-Fc}生物復合物中檢測抗體和二茂鐵含量的研究75-783.5免疫反響條件的優(yōu)化783.6基于{_dAb-ZnO-Fc}生物復合物的電化學放大免疫分析78-803.7電化學免疫技術的重現(xiàn)性、特異性和穩(wěn)定性研究803.8實際樣品中大腸桿菌的檢測80-814.結論81參考文獻81-84第五章巰基糖衍生物功能化的電化學生物傳感器用于活體腫瘤細胞外表多聚糖的競爭檢測84-1011.引言84-862.實驗局部86-882.1試劑與儀器862.2細胞的培養(yǎng)與處理86-872.3{ConA-MWNT-HRP}生物復合物的制備872.4巰基糖衍生物的合成87-882.5巰基糖衍生物功能化的電化學生物傳感器的制備882.6酶放大的電化學檢測883.結果與討論88-983.1巰基糖衍生物功能化的電化學生物傳感器的表征88-903.2{ConA-MWNT-HRP}生物復合物的表征90-913.3巰基糖衍生物功能化的電化學生物傳感器的競爭檢測機理91-923.4檢測條件的優(yōu)化92-933.5不同電化學生物傳感器性能的比較93-943.6電化學檢測腫瘤細胞94-963.7腫瘤細胞外表甘露糖的檢測96-984.結論98參考文獻98-101第六章凝集素電化學生物傳感器用于活體腫瘤細胞外表多聚糖的檢測研究101-1161.引言101-1032.實驗局部103-1042.1試劑與儀器1032.2{lectin-Au-Th}生物復合物的制備103-1042.3凝集素電化學生物傳感器的制備1042.4細胞外表多聚糖的電化學檢測1043.結果與討論104-1123.1{lectin-Au-