基因芯片技術(shù)在環(huán)境微生物群落研究中的應(yīng)用第1頁(yè)/共16頁(yè)摘要本文按照基因芯片探針的設(shè)計(jì)方法,將環(huán)境樣品群落研究基因芯片分為系統(tǒng)寡核苷酸芯片、功能基因芯片、群落基因組芯片、宏基因組芯片,并簡(jiǎn)要綜述了該技術(shù)在活性污泥、土壤、水等環(huán)境樣品微生物群落研究上的應(yīng)用。最后,本文展望了該技術(shù)的研究方向和在尋找不同環(huán)境微生物群落之間差異微生物、差異基因或差異表達(dá)基因研究中的應(yīng)用前景。第2頁(yè)/共16頁(yè)基因芯片基因芯片,又稱DNA微探針陣列(microarray),是一種最重要的生物芯片。它的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法是一致的,都是應(yīng)用已知核酸序列作為探針與互補(bǔ)的靶核苷酸序列雜交,通過(guò)隨后的信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行定性與定量分析?；蛐酒谝晃⑿〉幕?硅片、玻片、塑料片等)表面集成了大量的分子識(shí)別探針,能夠一次分析大量的基因,進(jìn)行大信息量的篩選與檢測(cè)。第3頁(yè)/共16頁(yè)環(huán)境樣品及其環(huán)境微生物群落研究環(huán)境樣品包括活性污泥、土壤、水、煙、氣溶膠、淤泥、海洋沉積物等。而環(huán)境微生物群落研究包括環(huán)境樣品的微生物分布、種類、功能、動(dòng)力學(xué)變化及氣候、環(huán)境污染等環(huán)境因素改變對(duì)其微生物生態(tài)的影響等。第4頁(yè)/共16頁(yè)環(huán)境樣品群落研究基因芯片的種類鑒于環(huán)境樣品的特點(diǎn),不是所有種類的基因芯片都適于環(huán)境微生物群落研究。按照基因芯片探針的設(shè)計(jì)方法,用于環(huán)境樣品群落研究的基因芯片主要有：系統(tǒng)寡核苷酸芯片、功能基因芯片、群落基因組芯片、宏基因組芯片第5頁(yè)/共16頁(yè)系統(tǒng)寡核苷酸芯片系統(tǒng)寡核苷酸芯片建立在系統(tǒng)標(biāo)記基因如rRNA基礎(chǔ)之上。rRNA是研究細(xì)菌進(jìn)化和親源關(guān)系的重要指標(biāo),是細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)最有用和常用的分子鐘。16SrRNA是最常用的作為細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記分子。它由多個(gè)高度保守的區(qū)段和可變區(qū)段組成,保守性序列基本保守,反映生物物種的親緣關(guān)系,因此可以利用恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物將16SrRNA片段擴(kuò)增出來(lái);高變性則揭示生物物種的特征核酸序列,其序列因不同細(xì)菌而異,因此可利用可變區(qū)序列的差異來(lái)設(shè)計(jì)不同菌屬、菌種的探針。第6頁(yè)/共16頁(yè)由于16SrDNA序列在原核生物中的高度保守性,對(duì)于近緣種或同一種內(nèi)的不同菌株之間的鑒別分辯力較差,因此只適于研究屬及屬以上水平的菌株。系統(tǒng)寡核苷酸芯片是目前應(yīng)用最廣的一種基因芯片,利用該技術(shù)已經(jīng)成功對(duì)堆肥、土壤、活性污泥、鈾污染含水土層等環(huán)境樣品進(jìn)行了微生物檢測(cè)、菌群動(dòng)力學(xué)、多樣性和結(jié)構(gòu)分析。第7頁(yè)/共16頁(yè)功能基因芯片（FGA）功能基因芯片通常建立在催化生化反應(yīng)的關(guān)鍵功能基因之上,這些基因包括了那些與研究對(duì)象有確定關(guān)系的基因,或至少是與研究對(duì)象的關(guān)系有待考證的基因。作為FGA候選基因應(yīng)該具有的特點(diǎn)：(1)該基因是參與生化過(guò)程的關(guān)鍵酶或蛋白質(zhì)編碼基因;(2)

進(jìn)化保守但在不同微生物之間具有足夠的變異,從而可以對(duì)不同菌株設(shè)計(jì)探針;(3)不同的基因在數(shù)據(jù)庫(kù)的序列信息量是不同的,應(yīng)該選擇在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中具有翔實(shí)序列信息的有關(guān)基因。第8頁(yè)/共16頁(yè)根據(jù)FGA的目的及其雜交靶標(biāo)的種類,FGA分為功能分類基因芯片和基因表達(dá)芯片。前者的目的主要是研究菌群是否具有這些特定反應(yīng)過(guò)程及其功能的分布、變化、多樣性,其雜交靶標(biāo)是菌群DNA的PCR產(chǎn)物。而后者用于研究這些特定功能基因的生理活性及其基因表達(dá)情況,需提取環(huán)境樣品的mRNA,其雜交靶標(biāo)是菌群cDNA的PCR產(chǎn)物。第9頁(yè)/共16頁(yè)FGA的探針主要是功能基因的PCR產(chǎn)物或合成的寡核苷酸,其中,前者通過(guò)對(duì)某些微生物功能基因保守序列設(shè)計(jì)引物,從而擴(kuò)增出相關(guān)基因;而后者是通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列信息直接設(shè)計(jì)的。目前,FGA應(yīng)用推廣的限制性瓶頸在于功能基因數(shù)據(jù)庫(kù)的不完整性和某些微生物的不易培養(yǎng)性。第10頁(yè)/共16頁(yè)群落基因組芯片(CGA)群落基因組芯片(CGA)是一種將可培養(yǎng)微生物的全基因組DNA作為探針的技術(shù),它的特異性高,可以鑒定到種甚至菌株水平;敏感性強(qiáng),只需0.2ng的待分析基因組DNA就可檢測(cè)。CGA在微生物檢測(cè)、鑒定、量化、不同環(huán)境樣品的微生物菌群相關(guān)性或不同微生物基因組的相關(guān)性分析等方面將有著廣泛的前景。第11頁(yè)/共16頁(yè)宏基因組芯片(MGA)未培養(yǎng)微生物組成了地球上生物多樣性的主體,據(jù)估計(jì),自然環(huán)境中超過(guò)99%的微生物不能用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行純培養(yǎng),因此,人們開始通過(guò)免培養(yǎng)的技術(shù)即宏基因組或直接從環(huán)境樣品中抽提克隆微生物的混合DNA來(lái)研究環(huán)境樣品中微生物基因組的功能和序列分析。目前,利用該技術(shù)已進(jìn)行了酸礦外排液和SargassoSea的微生物群落、活性污泥和土壤細(xì)菌PHB代謝遺傳學(xué)等的研究。第12頁(yè)/共16頁(yè)宏基因組芯片則是一種高通量文庫(kù)篩選技術(shù),是一種將芯片技術(shù)和宏基因組技術(shù)結(jié)合起來(lái)新技術(shù),該技術(shù)無(wú)需分離培養(yǎng)菌株、無(wú)需了解菌群的基因序列。它的探針來(lái)源于環(huán)境DNA的宏基因組文庫(kù),可通過(guò)大腸桿菌作為宿主來(lái)構(gòu)建,一般來(lái)說(shuō),MGA所包含的探針為1kb左右。第13頁(yè)/共16頁(yè)該技術(shù)可以分析環(huán)境樣品微生物結(jié)構(gòu)和功能;可以通過(guò)不同環(huán)境樣品宏基因組芯片的比較分析獲得某環(huán)境樣品菌群的代表DNA探針。目前,MGA技術(shù)仍在發(fā)展初期,但由于環(huán)境中存在大量的未知基因序列,因此它在環(huán)境方面將具有巨大的應(yīng)用價(jià)