1.

抗原多肽的設(shè)計2.

抗原多肽的偶聯(lián)策略3.多肽合成簡介4.抗多肽血清的制備5.血清的檢測當前1頁，總共44頁。1.抗原多肽的設(shè)計

為產(chǎn)生有效的抗體，第一步是設(shè)計好的抗原，此抗原可以來源于整個蛋白質(zhì)的一部分：一個或幾抗原決定簇區(qū)域的序列。（1）什么是抗原決定簇？蛋白質(zhì)表面部分可以使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的區(qū)域叫抗原決定簇。一般抗原決定簇是由6－12氨基酸或碳水基團組成，它可以是由連續(xù)序列（蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)）組成或由不連續(xù)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)組成。當前2頁，總共44頁。（2）選擇抗原決定簇為選擇好的抗原決定簇，應(yīng)符合以下三點：1．親水性(Hydrophilicity)：大部分抗原決定簇是親水性的；2．表面可接觸性(SurfaceAccessibility)：大部分抗體只與蛋白質(zhì)表面部分結(jié)合；3．有彈性(flexibility)：許多已知的抗原決定簇是在自由活動區(qū)域。所以一般來說蛋白質(zhì)的N端及C端是很好的抗原決定簇區(qū)域。當前3頁，總共44頁。（3）抗原性與免疫原性單獨的抗原決定簇是不能產(chǎn)生免疫反應(yīng)，它只有抗原性但沒有免疫原性，為使它能具有免疫原性，它必須偶聯(lián)在載體蛋白上。（4）抗原決定簇的預測對每個氨基酸的表面可接觸性、親水性和彈性進行計算可以大體推算出抗原決定簇區(qū)域，抗原決定簇區(qū)域應(yīng)綜合以上三個特點。目前市面上有幾個專業(yè)測定軟件滿足需要：如MacVestor,Protean,GCG等。備注當前4頁，總共44頁。（5）設(shè)計多肽序列的長度抗原性區(qū)域確定以后，接下來要確定多肽的長度。關(guān)于選定多肽長度有兩種不同的觀點。一種觀點認為長的多肽（20－40個氨基酸）比較好，因為長的多肽無疑會增加抗原基的數(shù)量。另一種觀點則認為小的多肽更有效，使用小的多肽能保障所產(chǎn)生抗體的位點特異性。但有一點是明確的，不管長度如何，所選多肽必須能夠較容易地通過生化合成得到，并且能溶解到水溶性緩沖劑進行載體蛋白的耦聯(lián)。由于受副反應(yīng)的影響較大，高于二十個氨基酸的多肽通常很難進行高純度合成，并且常常會含有缺失性序列。當前5頁，總共44頁。另一方面，太短的多肽（<10個氨基酸）則會產(chǎn)生識別特異性很強的抗體，以至于無法識別整體蛋白，或親和性很低。因此綜合考慮制備性抗原地多肽有效長度一般是10－20個氨基。這種長度的多肽序列會最大程度的減小生化合成困難，具有一定的水溶性，也會具有一定程度的二級結(jié)構(gòu)。（6）設(shè)計合成多肽一旦抗原序列決定后，接下來就是設(shè)計所需合成的多肽了，設(shè)計時除了注意其序列外，同時應(yīng)考慮一些產(chǎn)生免疫機制問題，如：1．載體蛋白的接入位置。當前6頁，總共44頁。2．如果其序列是位于蛋白C端的，此多肽C端一定是自由的羧基團，而N端被掩蓋。同時如果載體蛋白是通過半胱氨酸偶聯(lián)，此半胱氨酸應(yīng)處于N端位置，使C端完全暴露給免疫系統(tǒng)。3．相反，如果其序列是位于蛋白質(zhì)N端，此多肽C端應(yīng)掩蓋，暴露出N端，而載體蛋白應(yīng)在C端。當前7頁，總共44頁。2.抗原多肽的耦聯(lián)策略化學合成的多肽抗原是小分子，本身很難具有好的抗原性，只能誘導動物產(chǎn)生很弱的免疫反應(yīng)，因而與載體蛋白耦聯(lián)是很重要的。載體蛋白含有很多抗原決定基，能夠刺激T細胞，進而誘導B細胞反應(yīng)。用于與多肽耦聯(lián)的載體蛋白有多種，其中最常用的是(keyholelimpethemacyanin(KLH),牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA),卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和牛甲狀腺球蛋白(bovinethyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，是最為常用的多肽耦聯(lián)載體。BSA也常用來作為多肽載體，但由于BSA經(jīng)常被用做檢測試驗的阻斷劑而使得該方法生產(chǎn)的抗體在應(yīng)用上存在著一定的局限性。當前8頁，總共44頁。設(shè)計合成性多肽常常被忽略的一個方面是如何將多肽耦聯(lián)到載體蛋白上。例如，N-端序列需要通過C-端氨基酸耦聯(lián)，而C-端序列則需要通過N-端氨基酸耦聯(lián)。內(nèi)部序列則可以耦聯(lián)到任何一端。內(nèi)部序列耦聯(lián)的另一考量則是將非共軛端?；虬被?，因為原蛋白分子序列中不會含有帶電荷的末端。最常用的耦聯(lián)方法都是基于自由氨基(alph-氨基或Lys)、sufhydryl(Cys)或羧基集團(Asp,Glu,或alpha-羧基)的存在。所有的耦聯(lián)方法都應(yīng)該是通過羧基或氨基端殘基將多肽耦聯(lián)到載體蛋白上。所選序列不能有多個殘基都能參與所選耦聯(lián)化學反應(yīng)。如果多個反應(yīng)位點存在，可以考慮將多肽序列縮短，或者選擇所有反應(yīng)位點都位于一端的多肽。對于內(nèi)部序列通常會使用離所預測抗原位點較遠的一端進行耦聯(lián)，這樣可以避免可能的屏蔽問題。當前9頁，總共44頁。除非研究人員另做說明，我們通常使用EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide

hydrochloride)或carbodiimide方法將多肽和載體進行耦聯(lián)。Carbodiimides能激活天冬酰胺酸及谷氨酸的側(cè)鏈羧基集團及末端羧基集團，使之與主胺基發(fā)生耦聯(lián)反應(yīng)。激活的多肽與載體蛋白混合而產(chǎn)生最終的共軛體。如果載體蛋白先被激活，EDC方法則通過N-末端alpha-氨基，或者，如果序列中有賴氨酸的話，則可以通過賴氨酸的側(cè)鏈氨基與載體蛋白耦聯(lián)。m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide酯(MBS)是一種雙性多肽耦聯(lián)試劑，可以將多肽與載體蛋白通過半胱氨酸耦聯(lián)。耦聯(lián)發(fā)生在半胱氨酸的硫醇基。當前10頁，總共44頁。如果多肽序列中不包括半胱氨酸，可以將一個半胱氨酸加到多肽的N-端或C-端，以獲得可控性更強的多肽與載體蛋白的耦聯(lián)。為了合成方便，我們建議將半胱氨酸加到多肽的N-末端。戊二醛是一種雙作用耦聯(lián)試劑，可以將兩個化合物通過氨基集團耦聯(lián)在一起。戊二醛能起到非常靈活的間隔多肽和載體蛋白的作用，時多肽能盡可能的暴露給免疫系統(tǒng)。但是，戊二醛是一種反應(yīng)性很強的化合物，可以和Cys,Tyr及His等氨基酸發(fā)生一定程度的反應(yīng)。反應(yīng)后會形成結(jié)構(gòu)很難預測的共軛體。因此，如果多肽序列末端只含有一個單一的自由氨基時，戊二醛方法非常有用。如果多肽含有多個自由氨基集團，會形成多聚合物，結(jié)構(gòu)很難預測，盡管有很高的抗原性。當前11頁，總共44頁。因為與牛血清白蛋白（BSA）耦聯(lián)的多肽刺激產(chǎn)生的抗血清也含有針對BSA的抗體，一次可能導致假陽性結(jié)果。盡管KLH較大并有抗原性，但它在耦聯(lián)過程中可能會沉淀，因而有時候會很難處理。卵清蛋白（OVA）是另一種可以使用的載體蛋白。當要檢驗抗體只是針對多肽而不是針對載體蛋白時，OVA時用作第二載體的很好選擇。當要將抗體抗載體蛋白的反應(yīng)降到最低時，可以使用兔血清白蛋白做載體。當前12頁，總共44頁。用RSA耦聯(lián)體免疫過的兔子不太可能產(chǎn)生針對載體的抗體，因為RSA是兔子自身的蛋白。如果注射動物不是兔子RSA則不會被認為是自體蛋白。免疫系統(tǒng)是對多肽－載體蛋白整體發(fā)生反應(yīng)的，即免疫反應(yīng)有一部分是針對耦聯(lián)多肽，一部分是針對中間連接體，有一部分是針對載體蛋白。當用ELISA做篩選時建議使用不同載體蛋白耦聯(lián)的多肽聚合物。如果ELISA是在非耦聯(lián)多肽涂層的多孔板上做時則沒有必要這樣做。當前13頁，總共44頁。3.多肽合成原理

3.1多肽簡介肽鍵是蛋白質(zhì)分子中氨基酸間的主要連接方式，是一個alpha-NH2和一個alpha-COOH脫水縮合而成的酰胺鍵。一個氨基酸的α-羧基與另一個氨基酸的α-氨基之間失去一分子水相互連接而成的化合物稱為肽(peptide),由2個氨基酸縮合形成的肽叫二肽，由3個氨基酸縮合形成的肽叫三肽，少于10個氨基酸的肽稱為寡肽，由10個以上氨基酸形成的肽叫多肽，因此蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)就是多肽鏈結(jié)構(gòu)。每個肽在其一端有一自由氨基，稱為氨基端或N-末端，在另一端有一自由羧基，稱為羧基端或C-末端。當前14頁，總共44頁。3.2多肽合成原理化學合成多肽就把氨基酸按照一定的氨基酸排列順序和連接方式連接起來。為了得到具有特定氨基酸順序的合成多肽，采用逐步縮合的定向合成方法，即先將不需要反應(yīng)的氨基或羧基用適當?shù)幕鶊F保護起來，再進行連接反應(yīng)，以保證反應(yīng)的定向進行。當前15頁，總共44頁。對于長肽合成，一般有逐步增長和片段縮合兩種方式，前者由起始氨基酸（或肽）開始，每連接一次增長一個氨基酸，后者由C保護肽同N保護肽縮合來得到兩者長度相加的新肽鏈。3.3氨基保護氨基保護常用的保護基分為烷氧羰基、酰基，和烷基三大類。因為N烷氧羰基的保護的氨基酸在接肽時不易發(fā)生消旋化，故烷氧羰基使用最多。當前16頁，總共44頁。當前17頁，總共44頁。3.4羧基保護目前使用的羧基保護大致可以分為三種一種可以用堿皂化脫去，如甲酯、乙酯另一種可以用酸脫去，如叔丁酯、對甲氧芐酯，鄰苯二甲酰亞胺甲酯等第三種除了用酸或堿脫去外，還可以用其他的方法選擇性脫去，如芐酯、苯羰基甲酯、三甲硅乙酯當前18頁，總共44頁。當前19頁，總共44頁。3.5側(cè)鏈功能團的保護由于不少氨基酸的側(cè)鏈都帶有能反應(yīng)的基團，如羥基、巰基、酚基、B-和r-羧基、胍基、咪唑基、吲哚基和硫醚基等，為了避免副反應(yīng)的發(fā)生，在多肽合成中往往也選用適當?shù)谋Ｗo基將它們保護起來當前20頁，總共44頁。3.6肽鍵生成的方法形成肽鍵的方法基本可以分為四類：一是羧基活化法；二是氨基活化法；三是四組份合成法；四是利用蛋白水解酶的逆反應(yīng)，亦稱酶促合成法。

羧基活化法的基本原理是先將N-保護氨基酸或肽的a-羧基轉(zhuǎn)變成活化型的RCOX，從而有利于NH2R’對它進行親核反應(yīng)生成RCONHR’。一般來說，取代基團X的吸電子性越強，其對羧基的活化能力也越強。當前21頁，總共44頁。羧基取代基的活化能力順序當前22頁，總共44頁。3.7肽鍵生成的方法羧基活化法有碳二亞胺法、混合酸酐法、活化酯法、NCA法等1.碳二亞胺法當前23頁，總共44頁。2、混合酸酐法:反應(yīng)一般分兩部進行副反應(yīng)：當前24頁，總共44頁。歧化反應(yīng)和酸酐分解：當前25頁，總共44頁。二酰胺的形成：當前26頁，總共44頁。羧酸酯氨解生成酰胺的反應(yīng)是胺對酯進行親核取代，因此增加R‘基團的吸電子能力必將增加羰基碳原子的正電性而有利于氨解反應(yīng)的進行。3、活化酯法當前27頁，總共44頁?；罨サ姆N類：1）芳基活化酯2）烯基酯3）與N-羥基化合物形成的活化酯4）活化酰胺5）固相活化酯活化酯的制備：1）DCC法2）轉(zhuǎn)酯反應(yīng)3）加成4）混合酸酐法當前28頁，總共44頁。4、NCA法優(yōu)點：1）反應(yīng)速度快，肽合成周期短2）得到的氨基游離的肽可直接用于第2輪的肽合成3）側(cè)鏈可以較少的保護，除NCA的側(cè)鏈需保護外，氨基組分只有Lys和Cys必須保護4）反應(yīng)有可能在水溶液中進行。當前29頁，總共44頁。NCA的合成：酰氯法、光氣法當前30頁，總共44頁。3.8固相合成固相合成的主要設(shè)計思想是：先將所要合成肽鏈的末端氨基酸的羧基以共價鍵的結(jié)構(gòu)同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組分經(jīng)過脫去氨基保護基并同過量的活化羧基組分反應(yīng)接長肽鏈。這樣的步驟可以重復的多次進行下去，即縮合→洗滌→去保護→中和和洗滌→下一輪縮合，最后達到所需要合成的肽鏈長度。當前31頁，總共44頁。固相合成流程示意：當前32頁，總共44頁。氨基酸在進入目的肽之前，氨基端需要保護基。根據(jù)保護基的不同，多肽固相合成方法可以分為兩大類：Boc方法和Fmoc方法。當前33頁，總共44頁。4.抗多肽血清的制備4.1動物選擇

要生成好的抗體，必須選擇與抗原源差異較大的動物。要想獲得最大的免疫反應(yīng)，絕對不能讓免疫動物對抗原產(chǎn)生‘自體識別’。例如，要想生成抗人體蛋白的抗體，使用兔或老鼠比使用猴子要好。對于非常保守的哺乳動物蛋白，使用鳥類動物（如雞）效果較好。當前34頁，總共44頁。4.2動物免疫

我們通常使用弗氏佐劑（Freund's）與抗原進行混合。第一次注射完全使用Freund's的免疫輔助劑。輔助劑與抗原聯(lián)合使用，可以提高免疫反應(yīng)，從而用較少的疫苗可以產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng)。佐劑可以使抗原緩慢釋放，從而產(chǎn)生持續(xù)性刺激。注射方式為多位點的皮下注射。每只注射動物都要先收集免疫前血樣，以用于和以后的免疫血樣比較。所采集的血清樣本含有不同的免疫型和亞型。備注當前35頁，總共44頁。4.3抗多肽血清的制備（SOP）一、材料(帶√項目見附錄1)1、家兔：健康雄性家兔。至少準備2只家兔，以防一只家兔死亡或者免疫接種失敗。2、肽一載體：上海強耀生物，規(guī)格2.5mg肽/瓶。3、PBS，(0.01mo1/L、pH7.4)4、弗氏完全佐劑（FCA）(sigma)5、弗氏不完全佐劑（FICA）(sigma)6、免疫抗原的制備取2.5mg肽-KLH溶解到2.5ml的PBS中，然后加入等體積的弗氏完全佐劑混合乳化（采用雙頭抽吸裝置乳化）。每只家兔接種混合物2.5mL。如果是用弗氏不完全佐劑時，將上述“弗氏完全佐劑”替換為“弗氏不完全佐劑”。當前36頁，總共44頁。序號佐劑劑量（ml/只）免疫途徑間隔時間計劃時間1FCA總量2.5ml,每點約0.2-0.4ml脊柱兩側(cè)（2-4點）和腹股溝部（2-4點）多點皮內(nèi)和臀部肌肉注射（2點）07月16日2FICA總量2.5ml,每點約0.2-0.4ml脊柱兩側(cè)（2-4點）和腹股溝部（2-4點）多點皮內(nèi)和臀部肌肉注射（2點）14-21

7月30日3FICA總量2.5ml,每點約0.2-0.4ml脊柱兩側(cè)（2-4點）和腹股溝部（2-4點）多點皮內(nèi)和臀部肌肉注射（2點）21-288月21日4采集血清21-289月10日二、試驗操作程序1、免疫程序的確定2、操作步驟當前37頁，總共44頁。（1）收集血樣(如從耳動脈或耳靜脈)，每只家兔準備2～5ml免疫前的血清。（由于本實驗室已經(jīng)儲備家兔免疫前血清，本步驟可以省略）。（2）按表1中免疫程序進行免疫。a）將0.7～1.0mg的肽一載體的連接體溶于1ml的PBS，并加入1mlFCA徹底混溶。每只家兔免疫接種1ml這種穩(wěn)定的乳濁液，在皮下多個位點接種，每個位點0.1～0.2ml。b)2～6周后(或檢測到免疫反應(yīng)減弱時較理想；準備一份新的乳濁制劑追加劑量，使用相同的連接體但添加的是弗氏不完全佐劑。如上所述在皮下多個位點接種。若免疫原的量有限，則使用初次免疫接種量的1/4。注意加強免疫時注意家兔皮膚潰瘍情況，如有，減少皮下注射、以肌肉注射為主。當前38頁，總共44頁。c）在加強免疫后3-4周,再次加強免疫一次。注意：不要第三次加強免疫。(3)最后一次接種后3～4周后再次取血。采血前1-2天，停料、保證充分飲水。(4)血清的析出和保存新鮮采集的血液在室溫或37℃靜置0.5-1h，使其自然凝固。用細長撥針沿管壁輕輕地繞一周，使血凝塊同管壁分離。4℃過夜、使血凝塊收縮。小心吸出血清，不要吸到血凝塊。對剩余或析出血清量少的可以在4℃、10000離心10min，但注意單獨分裝。制備血清時的溶血會影響血清質(zhì)量，出現(xiàn)假陽性。當前39頁，總共44頁。溶血原因：（1）術(shù)部消毒酒精不干，注射器、術(shù)者、析血清用塑料或玻璃管潮濕；（2）采血是真空度過大、抽血速度過快；（3）從采血針管內(nèi)將血液注入析血清用塑料或玻璃管時，沒有去針頭或速度過快。(5)血清保存如要防腐加疊氮化鈉使終濃度為0.02%。血清一般在凍存前分裝成100-500μL,-20℃可存放數(shù)年。解凍可在不高于室溫（25℃）或4℃下進行，并存于4℃，工作液4℃可存放數(shù)月。注意：4℃存放時可能產(chǎn)生不溶性脂類，似微生物污染，可10000g離心除去。如離心后在上層可以將液相吸出。(6)血清中抗體效價測定可選：通過免疫親和層析法，將抗血清中不需要的成分(如抗載體的抗體)去掉以純化抗肽的抗體。當前40頁，總共44頁。4.5抗體鑒定

檢測抗多肽反應(yīng)是否發(fā)生的最簡單方法就是抗多肽ELISA。有兩種技術(shù)可以