各類干細(xì)胞應(yīng)用特點研究比較徐瑞權(quán)當(dāng)前1頁，總共108頁。干細(xì)胞研究的重要性：美國《Science》雜志1999年——將“干細(xì)胞研究的新發(fā)現(xiàn)”列入十大科技進(jìn)展之首2000年——再次入選年度十大科技進(jìn)展2002年——列入值得關(guān)注的六大科技領(lǐng)域之一至今——干細(xì)胞各領(lǐng)域的研究飛速發(fā)展美國加州每年提供干細(xì)胞研究經(jīng)費達(dá)3億美元當(dāng)前2頁，總共108頁。我國有關(guān)干細(xì)胞的研究也十分活躍，已有多個有關(guān)干細(xì)胞的“973”項目，召開過多次全國性或國際性學(xué)術(shù)會議，出版過多本專（譯）著?！?63”計劃近期將為干細(xì)胞研究提供2億元人民幣的經(jīng)費。當(dāng)前3頁，總共108頁。干細(xì)胞治療的特點1.一次性介入，永久性治療；2.不需要完全了解疾病發(fā)生的確切機理；3.可應(yīng)用于自身干細(xì)胞移植，避免產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。當(dāng)前4頁，總共108頁。干細(xì)胞應(yīng)用的基礎(chǔ)——調(diào)控干細(xì)胞的調(diào)控是指給出適當(dāng)?shù)囊蜃訔l件，對干細(xì)胞的增值和分化進(jìn)行調(diào)控，使之向指定的方向發(fā)展。包括：內(nèi)源性調(diào)控外源性調(diào)控當(dāng)前5頁，總共108頁。內(nèi)源性調(diào)控干細(xì)胞自身有許多調(diào)控因子可對外界信號起反應(yīng)從而調(diào)節(jié)其增殖和分化：（1）細(xì)胞內(nèi)蛋白對干細(xì)胞分裂的調(diào)控：在果蠅卵巢中，調(diào)控干細(xì)胞不對稱分裂的是一種稱為收縮體的細(xì)胞器，包含有許多調(diào)節(jié)蛋白，如膜收縮蛋白和細(xì)胞周期素A。收縮體與紡錘體的結(jié)合決定了干細(xì)胞分裂的部位，從而把維持干細(xì)胞性狀所必需的成分保留在子代干細(xì)胞中。當(dāng)前6頁，總共108頁。

（2）轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控在胚胎干細(xì)胞的發(fā)生中，轉(zhuǎn)錄因子Oct4是必需的。Oct4是一種哺乳動物早期胚胎細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，它誘導(dǎo)表達(dá)的靶基因產(chǎn)物是FGF-4等生長因子，能夠通過生長因子的旁分泌作用調(diào)節(jié)干細(xì)胞以及周圍滋養(yǎng)層的進(jìn)一步分化。Oct4缺失突變的胚胎只能發(fā)育到囊胚期，其內(nèi)部細(xì)胞不能發(fā)育成內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)白血病抑制因子（LIF）Tcf/Lef轉(zhuǎn)錄因子

當(dāng)前7頁，總共108頁。外源性調(diào)控干細(xì)胞的分化還可受到其周圍組織及細(xì)胞外基質(zhì)等外源性因素的影響

（1）分泌因子間質(zhì)細(xì)胞能夠分泌許多因子，維持干細(xì)胞的增殖，分化和存活.有兩類因子在不同組織甚至不同種屬中都發(fā)揮重要作用，它們是TGFβ家族和Wnt信號通路。

當(dāng)前8頁，總共108頁。干細(xì)胞的分化還可受到其周圍組織及細(xì)胞外基質(zhì)等外源性因素的影響

（1）膜蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間的相互作用有些信號是通過細(xì)胞-細(xì)胞的直接接觸起作用的。β-Catenin就是一種介導(dǎo)細(xì)胞粘附連接的結(jié)構(gòu)成分。穿膜蛋白Notch及其配體Delta或Jagged也對干細(xì)胞分化有重要影響.

當(dāng)前9頁，總共108頁。干細(xì)胞的分化還可受到其周圍組織及細(xì)胞外基質(zhì)等外源性因素的影響

（3）整合素（Integrin）與細(xì)胞外基質(zhì)整合素家族是介導(dǎo)干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附的最主要的分子。整合素與其配體的相互作用為干細(xì)胞的非分化增殖提供了適當(dāng)?shù)奈h(huán)境。β1整合素當(dāng)前10頁，總共108頁。干細(xì)胞的分類及特點：胚胎干細(xì)胞成體干細(xì)胞誘導(dǎo)分化干細(xì)胞（iPS）當(dāng)前11頁，總共108頁。，可誘導(dǎo)分化為機體胚胎干細(xì)胞成體干細(xì)胞①來自胚泡的內(nèi)細(xì)胞群來源于骨髓、外周血、角膜、視網(wǎng)膜、腦、骨骼肌、齒髓、肝、皮膚、胃腸道粘膜層和胰腺等②發(fā)育全能性，可誘導(dǎo)分化為機體分化較局限，部分成體干細(xì)胞（造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞）有一定跨系、跨胚層的“可塑性”③無限的自我更新能力病理條件下才顯出一定的自我更新潛能④增殖能力強，便于應(yīng)用增殖能力較弱，故不能完全取代胚胎干細(xì)胞⑤細(xì)胞可不斷增殖，“永生化”，移植后有形成腫瘤的可能性成瘤的可能性很?、薏荒茏泽w移植自體移植可避免免疫排斥⑦有倫理問題分離和使用不存在倫理問題當(dāng)前12頁，總共108頁。胚胎干細(xì)胞

當(dāng)前13頁，總共108頁。

當(dāng)前14頁，總共108頁。衍生自囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始外胚層的細(xì)胞；永生化(immortal)；能維持穩(wěn)定的正常的二倍體染色體結(jié)構(gòu)；有穩(wěn)定的發(fā)育潛能，能被誘導(dǎo)增殖或分化；能參與胎兒所有組織的發(fā)育過程；

胚胎干細(xì)胞的性質(zhì)當(dāng)前15頁，總共108頁。胚胎干細(xì)胞系的建立過程當(dāng)前16頁，總共108頁。當(dāng)前17頁，總共108頁。當(dāng)前18頁，總共108頁。當(dāng)前19頁，總共108頁。當(dāng)前20頁，總共108頁。ES細(xì)胞研究的趨勢

改善ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件，建立更有效更簡便的獲得ES細(xì)胞的方法。定向誘導(dǎo)分化成特定類型細(xì)胞，用于臨床疾病的治療，并解決免疫排斥和潛在的致腫瘤的問題。成體干細(xì)胞的橫向分化的能力以及與胚胎干細(xì)胞的比較，成體干細(xì)胞能否替代胚胎干細(xì)胞？當(dāng)前21頁，總共108頁。胚胎干細(xì)胞的特點增殖速度：18－24h分裂增殖一次

hES必須在含有白血病抑止因子（LIF）的培養(yǎng)基及成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層(freedercell)條件下才能保持繁殖而不分化。

hES體外培養(yǎng)要解決的關(guān)鍵問題是維持細(xì)胞的分裂增殖而抑止其分化。具有分化形成外、中、內(nèi)三個胚層的潛能。能形成嵌合體動物，從而成為聯(lián)系細(xì)胞和個體之間的橋梁。當(dāng)前22頁，總共108頁。鑒定：人胚胎干細(xì)胞特異表面抗原的表達(dá)胚胎階段特異性抗原:SSEA-1SSEA-3SSEA-4

Thmoson分離的hES陰性弱陽性強陽性Gearhart分離的hES陽性弱陽性陽性小鼠ES陰性陰性陽性鼠和人胚胎干細(xì)胞表達(dá)的表面抗原有種屬差異。

Gearhart等認(rèn)為SSEA-1陽性可能是源于原始生殖細(xì)胞的多能干細(xì)胞分化的標(biāo)志.細(xì)胞膜表面有特殊的標(biāo)記：SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81當(dāng)前23頁，總共108頁。a

胚胎干細(xì)胞具有正常穩(wěn)定的二倍體核型和帶型。b胚胎干細(xì)胞具有較高的端粒酶活性及堿性磷酸酶的表達(dá)。

人胚胎干細(xì)胞系端粒酶活性都很高，說明其可在體外未分化狀態(tài)進(jìn)行長期培養(yǎng)。當(dāng)前24頁，總共108頁。鑒定.具有轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的表達(dá)

Oct-4只限定在多潛能細(xì)胞中表達(dá)。人和小鼠的胚胎干細(xì)胞都表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4，當(dāng)胚胎干細(xì)胞分化時，其表達(dá)能力大大降低。

Oct-4可能是哺乳動物不同發(fā)育階段多潛能細(xì)胞所特有的少數(shù)特異的調(diào)控分子之一。當(dāng)前25頁，總共108頁。胚胎干細(xì)胞鑒別鑒別不被Hoechst33342和Rhodamine123染色能分化成三個胚層的細(xì)胞，將胚胎干細(xì)胞植入免疫缺陷小鼠皮下可產(chǎn)生畸胎瘤可誘導(dǎo)分化為各種成體干細(xì)胞當(dāng)前26頁，總共108頁。注：人胚胎干細(xì)胞具有自我更新和多潛能的特性，以及以下一些特征：

1）可以從囊泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出來；2）在體外的增殖力非常強；3）在繼代的培養(yǎng)過程中保持正常的多倍體核型；4）可以分化為三個胚層的細(xì)胞；5）具有端粒酶活性當(dāng)前27頁，總共108頁。當(dāng)前28頁，總共108頁。

內(nèi)細(xì)胞群的細(xì)胞可以發(fā)育成除了胎盤以外的完整個體，因而這些細(xì)胞被認(rèn)為具有全能性。胚胎干細(xì)胞的優(yōu)點

——全能性當(dāng)前29頁，總共108頁。1.ES細(xì)胞的全能性主要體現(xiàn)在以下幾方面：①形成畸胎瘤。將ES細(xì)胞注人同源動物皮下可形成畸胎瘤，包括三個胚層細(xì)胞；②形成類胚體。培養(yǎng)ES細(xì)胞在非粘附底物中懸浮生長，或控制增殖細(xì)胞數(shù)目。能夠使之生成類胚體，它是一個與畸胎瘤相似的多種系混雜的集合體、具有三個胚層組織；③直系分化。通過控制ES細(xì)胞生長環(huán)境，或遺傳操縱特定基因表達(dá)，ES細(xì)胞可直接分化成某特定種系細(xì)胞，例如將神經(jīng)決定基因NeuroD2和NeuroD3轉(zhuǎn)人ES細(xì)胞，可使之分化為神經(jīng)細(xì)胞；④形成嵌合體。將ES細(xì)胞注射到同種動物囊胚腔中后，可以形成嵌合體（chimera），ES細(xì)胞可以參與嵌合體各個器官包括生殖腺的發(fā)育。這是檢驗一個細(xì)胞系是否為ES細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)前30頁，總共108頁。ES細(xì)胞生物學(xué)特性細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型細(xì)胞的高度分化潛能堿性磷酸酶的表達(dá)胚胎階段特異性細(xì)胞表面抗原的表達(dá)當(dāng)前31頁，總共108頁。1.各種動物的ES細(xì)胞具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，胞體體積小，核大，有一個或幾個核仁。

2.ES細(xì)胞與卵圓柱期（eggcylinderstage）胚胎外胚層和胎兒生殖峙的原始生殖細(xì)胞類似，而與ICM細(xì)胞有差異。

3.細(xì)胞中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡單，散布著大量核糖體和線粒體，核型正常，保留了整倍體性質(zhì)。正常ES細(xì)胞染色體正常，如發(fā)生異常則其很難發(fā)育分化形成動物個體。

4.ES細(xì)胞在體外分化抑制培養(yǎng)中，呈克隆狀生長，細(xì)胞緊密地聚集在一起，形似鳥巢，細(xì)胞界限不清，克隆周圍有時可見單個ES細(xì)胞和分化的扁平狀上皮細(xì)胞。

5.ES細(xì)胞增殖迅速，每18—24h分裂增殖1次。

6.此外，其還可以在體外進(jìn)行選擇、操作、凍存。凍存的細(xì)胞可在需要時隨時解凍，繼續(xù)培養(yǎng)不失其原有特性，并且來自一個克隆的細(xì)胞具有同樣的特征。1、ES細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型當(dāng)前32頁，總共108頁。

2、ES細(xì)胞的高度分化潛能

ES細(xì)胞的全能性是其區(qū)別于成纖維細(xì)胞等體細(xì)胞的顯著特點1.ES細(xì)胞在體外需在飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)才能維持其未分化狀態(tài)，一旦脫離飼養(yǎng)層就自發(fā)地進(jìn)行分化。2.在單層培養(yǎng)時細(xì)胞自發(fā)分化成多種細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)中：“簡單類胚體”“囊狀胚體”細(xì)胞分化物。3.ES細(xì)胞可進(jìn)行誘導(dǎo)分化*用RA（維生素A酸或視黃酸）作誘導(dǎo)90％以上的ES細(xì)胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。*聚集培養(yǎng)的ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化則可分化為有節(jié)律性收縮的心肌細(xì)胞。*將ES細(xì)胞注射到同源動物皮下，可形成組織瘤，其細(xì)胞組成可代表3個胚層細(xì)胞。*用ES細(xì)胞作核供體進(jìn)行細(xì)胞核移植，可以得到可發(fā)育重構(gòu)胚和動物個體。當(dāng)前33頁，總共108頁。

3.堿性磷酸酶的表達(dá)

許多資料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚細(xì)胞和囊胚細(xì)胞均有堿性磷酸酶（AKP）表達(dá)，小鼠的EC細(xì)胞和ES細(xì)胞中均含有豐富的AKP。而在已分化的EC細(xì)胞和ES細(xì)胞中AKP呈弱陽性或陰性。豬、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈陽性。因此，AKP常用來作為鑒定EC細(xì)胞或ES細(xì)胞分化與否的標(biāo)志之一。當(dāng)前34頁，總共108頁。4、胚胎階段特異性細(xì)胞表面抗原的表達(dá)早期胚胎細(xì)胞表面均表達(dá)胚胎階段特異性表面抗原（SSEA－1）。在胚胎的原始外胚層細(xì)胞、ES細(xì)胞、EC細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞的表面均可檢測到SSEA－1的表達(dá)。小鼠SSEA－1的表達(dá)自8一細(xì)胞期開始，直到原始外胚層形成期。早期囊胚ICM細(xì)胞全部呈強陽性，晚期囊胚中部分ICM呈強陽性，部分呈弱陽性，少部分為陰性。因此，SSEA也常作為ES細(xì)胞鑒定的一個標(biāo)志。當(dāng)前35頁，總共108頁。ES細(xì)胞的應(yīng)用前景

（1）ES細(xì)胞在動物克隆及人類治療性克隆中的應(yīng)用（2）在轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用（3）制備嵌合體動物當(dāng)前36頁，總共108頁。ES研究面臨的難題1、體外培養(yǎng)ES細(xì)胞應(yīng)當(dāng)是既能快速無限增殖，又呈未分化狀態(tài)。如何平衡這一對矛盾,必須篩選適宜的培養(yǎng)條件。目前在ES細(xì)胞研究中存在著建系成功率也不高等問題,只在小鼠中建立了穩(wěn)定的ES細(xì)胞系，家畜、人類細(xì)胞系建立的最佳條件仍無定論。當(dāng)前37頁，總共108頁。

2、ES細(xì)胞高度未分化,具有形成畸胎瘤的可能性,因此在使用ES細(xì)胞進(jìn)行治療前必須首先體外誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化產(chǎn)生某種特異的組織細(xì)胞或設(shè)計自殺基因,當(dāng)移植的細(xì)胞向腫瘤發(fā)展時,自殺基因能啟動自毀機制使其凋亡。但如何誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化成單一類型的分化細(xì)胞,是至今仍未解決的難題。因此，必須尋找各種細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的條件和方法，以及不同干細(xì)胞的表面標(biāo)志和分選技術(shù)，從而得到所需要的細(xì)胞或組織。當(dāng)前38頁，總共108頁。3、ES細(xì)胞真正用于器官克隆與移植仍需要技術(shù)上的突破，因為器官的形成是一個非常復(fù)雜的三維過程,很多器官是兩個不同胚層的組織相互作用而形成的。即便是發(fā)育完整的來自自然機體的器官,要離體培養(yǎng)并維持其正常的生理功能目前還無法做到,器官的體外保存和維持仍是器官移植中的難題。當(dāng)前39頁，總共108頁。4、最大的障礙來自于倫理學(xué)問題，特別是ES細(xì)胞應(yīng)用受到倫理、法律、宗教以及社會因素的強烈反對，有些國家甚至明令禁止進(jìn)行人類ES細(xì)胞研究。無論從基礎(chǔ)研究角度來講還是從臨床應(yīng)用方面來看，人類ES細(xì)胞帶給人類的益處遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在倫理方面可能造成的負(fù)面影響，但隨著觀念的改變，人們會逐漸認(rèn)識到ES細(xì)胞對臨床醫(yī)學(xué)及生物學(xué)理論研究的重要作用。當(dāng)前40頁，總共108頁。[WASHINGTON]TheUSNationalInstitutesofHealth(NIH)couldprovidefundingforresearchonhumanembryonicstemcellsasearlyasthespringifnewguidelines,publishedbytheNIHlastweekafterwidespreadpublicconsultation,areformallyapproved.Nature402,566(1999)[TOKYO]

Japan'scloningbanwillstillallowstemcellexperimentsNature404,321(2000)[LONDON]EuropeanpanelrejectscreationofhumanembryosforresearchNature408,277(2000)倫理學(xué)問題：當(dāng)前41頁，總共108頁。StemcellresearchquidlineDEPARTMENTOFHEALTHANDHUMANSERVICESPublicHealthServiceNationalInstitutesofHealthNationalInstitutesofHealthGuidelinesforResearchUsingHumanPluripotentStemCells

SUMMARY:TheNationalInstitutesofHealth(NIH)isherebypublishingfinalNationalInstitutesofHealthGuidelinesforResearchUsingHumanPluripotentStemCells.TheGuidelinesestablishprocedurestohelpensurethatNIH-fundedresearchinthisareaisconductedinanethicalandlegalmanner.當(dāng)前42頁，總共108頁。另外，利用胚胎干細(xì)胞進(jìn)行克隆性治療在目前尚受到多方面的限制胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的條件及分化成熟的鑒定標(biāo)準(zhǔn)尚不成熟，人們對如何避免分化不完全的胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)導(dǎo)致畸胎瘤的危險性仍不清楚人ESC用于臨床的疾病治療短期內(nèi)將難以實現(xiàn)當(dāng)前43頁，總共108頁。當(dāng)前44頁，總共108頁。解決胚胎來源有限的途徑：未成熟卵的體外成熟當(dāng)前45頁，總共108頁。（1）Knock-out胚胎干細(xì)胞的組織相容性抗原（2）Knock-in受者的組織相容性抗原（3）與同一來源的造血干細(xì)胞一同移植（4）受者的體細(xì)胞核移植避免免疫排斥的方法當(dāng)前46頁，總共108頁。分離、純化：隨著對胚胎干細(xì)胞研究的進(jìn)展，分離、純化技術(shù)得到較好的解決。當(dāng)前47頁，總共108頁。倫理學(xué)問題的解決：誘導(dǎo)產(chǎn)生多能性干細(xì)胞（IPS）的研究，充分解決了胚胎干細(xì)胞所面臨的倫理學(xué)問題。當(dāng)前48頁，總共108頁。誘導(dǎo)產(chǎn)生多能性干細(xì)胞的研究當(dāng)前49頁，總共108頁。細(xì)胞重編程的研究概況核移植：核移植試驗最初是在兩棲動物中實現(xiàn)的，通過將體細(xì)胞核注入到去核卵母細(xì)胞中，但具有很大的局限性。將成熟的體細(xì)胞與多潛能的細(xì)胞（ES細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞等）融合，或者用胚胎干細(xì)胞提取物來處理體細(xì)胞，也可以在一定程度上使體細(xì)胞發(fā)生重編程。但面臨許多倫理學(xué)問題。當(dāng)前50頁，總共108頁。有沒有相對簡單，又可擺脫材料來源和倫理學(xué)諸多限制，重編程的效率和程度都十分可觀的新方法呢？當(dāng)前51頁，總共108頁。2006年11月20日，日本京都大學(xué)的山中伸彌（ShinyaYamanaka)和美國威斯康星大學(xué)的詹姆斯·湯姆森（JamesThomson）分別在《細(xì)胞》和《科學(xué)》雜志上發(fā)表重量級論文，宣布他們用基因改造的手段，將人類體細(xì)胞改造成了類胚胎干細(xì)胞，在功能上幾乎可以和胚胎干細(xì)胞相媲美。當(dāng)前52頁，總共108頁。誘導(dǎo)產(chǎn)生多能性干細(xì)胞：幾個轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入已分化的細(xì)胞，進(jìn)而獲得了類似于胚胎干細(xì)胞的多能性干細(xì)胞，稱之為“誘導(dǎo)產(chǎn)生的多功能性干細(xì)胞”（inducedpluripotentstemcells,iPS細(xì)胞）。當(dāng)前53頁，總共108頁。方法：借助“逆轉(zhuǎn)錄酶病毒”為載體,即向皮膚細(xì)胞中植入一組4個基因(Oct4,Sox2,c-myc和Klf4)，通過基因重新編排，使皮膚細(xì)胞具備胚胎干細(xì)胞的功能。這種被改造過的細(xì)胞稱作“iPS細(xì)胞”。當(dāng)前54頁，總共108頁。當(dāng)前55頁，總共108頁。當(dāng)前56頁，總共108頁。當(dāng)前57頁，總共108頁。優(yōu)越性：1、利用iPS細(xì)胞作為實驗?zāi)Ｐ?，只操縱幾個因子的表達(dá)，加速對多能性調(diào)控機理的深入研究。2、獲得的方法相對簡單穩(wěn)定，不涉及胚胎的破壞，無倫理道德限制。3、對于疾病機理研究和新藥開發(fā)等方面將有很大貢獻(xiàn)。4、可望制造特定病人來源的iPS細(xì)胞，用“個性化”移植來治療諸多疾病。當(dāng)前58頁，總共108頁。iPS細(xì)胞檢測-hES標(biāo)記表現(xiàn)Sell-specificsurfaceantigens(Adewumietal.,2007)當(dāng)前59頁，總共108頁。iPS細(xì)胞檢測-hES標(biāo)記表現(xiàn)stage-specificembryonicantigen-1(SSEA-1)當(dāng)前60頁，總共108頁。Ips細(xì)胞研究中存在的問題1、腫瘤相關(guān)基因，如c-myc的使用，有誘發(fā)癌癥的可能。2、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染可能會導(dǎo)致一些癌基因的激活，也可能導(dǎo)致某些重要基因功能受阻。3、基因表達(dá)模式與ESC還存在一些不同。4、效率較低，重組率只有0.1%。當(dāng)前61頁，總共108頁。存在的問題IPS細(xì)胞與hES細(xì)胞的DNA分析結(jié)果顯示兩者之間仍有差異存在.效率不高：1/5×10^3cells挑選出的細(xì)胞群落參雜有HDF反轉(zhuǎn)錄病毒隨機插入而抑制相關(guān)基因一些沒有被核型分析檢測到的基因改變反轉(zhuǎn)錄病毒隨機插入可能會誘發(fā)癌癥當(dāng)前62頁，總共108頁。iPS細(xì)胞形成畸胎瘤內(nèi)胚層中胚層中胚層外胚層外胚層中胚層當(dāng)前63頁，總共108頁。iPS細(xì)胞形成畸胎瘤Invivo：將iPS細(xì)胞胞注射至嚴(yán)重免疫缺陷綜合癥(SCID)小鼠的背側(cè)皮下。九周后：產(chǎn)生腫瘤組織學(xué)檢測：腫瘤中含有各式各樣的組織Teratoma：畸胎瘤－包含有器官或是組織的腫瘤，類似三個胚層的衍生物。當(dāng)前64頁，總共108頁。IPS細(xì)胞插入基因檢測PCR顯示每個中都有插入四個逆轉(zhuǎn)錄病毒當(dāng)前65頁，總共108頁。IPS細(xì)胞非污染的產(chǎn)物免疫印跡分析，以c-MyccDNA為探針

由逆轉(zhuǎn)錄病毒的c-Myc內(nèi)生性的c-Myc當(dāng)前66頁，總共108頁。IPS細(xì)胞與hES細(xì)胞的DNA分析結(jié)果顯示兩者之間仍有差異存在效率不高：1/5×10^3cells

挑選出的細(xì)胞群落參雜有HDF反轉(zhuǎn)錄病毒隨機插入而抑制相關(guān)基因一些沒有被核型分析檢測到的基因改變反轉(zhuǎn)錄病毒隨機插入可能會誘發(fā)癌癥當(dāng)前67頁，總共108頁。成體干細(xì)胞是存在于成體動物的許多組織和器官，具有修復(fù)和再生的能力的細(xì)胞。成體干細(xì)胞大多數(shù)時候處于靜息狀態(tài)。在特定條件下，成體干細(xì)胞或者產(chǎn)生新的干細(xì)胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能細(xì)胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。成體干細(xì)胞

（adultstemcell，ASC）當(dāng)前68頁，總共108頁。各類成體干細(xì)胞：當(dāng)前69頁，總共108頁。

當(dāng)前70頁，總共108頁。

干細(xì)胞名稱Stemcellniche干細(xì)胞標(biāo)志分化細(xì)胞標(biāo)志分化促進(jìn)因子神經(jīng)祖細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞側(cè)腦室室管膜細(xì)胞巢素蛋白CD133微管結(jié)合蛋白-2神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白GFAP表皮生長因子成纖維細(xì)胞生長因子表皮干細(xì)胞毛囊干細(xì)胞基底細(xì)胞角蛋白15K5、K14Wnt腸干細(xì)胞腸腺基部及近基部K8、K18、K19

肝干細(xì)胞Hering管門管區(qū)膽管周圍卵圓細(xì)胞：OV-6、c-kit、CD34、AFP小肝細(xì)胞：

間充質(zhì)干細(xì)胞骨髓竇的內(nèi)腔面SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD99、CD106、CD124、CD120a、多種組織標(biāo)志（如骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-BMPR）多種誘導(dǎo)因素造血干細(xì)胞骨髓、臍帶血、外周血

當(dāng)前71頁，總共108頁。成體干細(xì)胞的優(yōu)點

成體干細(xì)胞則可從患者自身獲得，不存在組織相容性的問題。成體干細(xì)胞不會誘發(fā)畸胎瘤的發(fā)生。成體干細(xì)胞也不存在倫理學(xué)爭執(zhí)。當(dāng)前72頁，總共108頁。成體干細(xì)胞的不足尚未從人體的全部組織中分離出成體干細(xì)胞.成體干細(xì)胞含量極微，很難分離和純化，且數(shù)量隨年齡增長而降低在一些遺傳缺陷疾病中，遺傳錯誤很可能也會出現(xiàn)于病人的干細(xì)胞中，這樣的干細(xì)胞不適于移植成人身上獲得的干細(xì)胞可能沒有年輕人的干細(xì)胞那樣的增殖能力由于日常生活中人是暴露在各種環(huán)境之下，日光和毒素等都有可能造成基因突變，成體干細(xì)胞可能包含更多的DNA異常。當(dāng)前73頁，總共108頁。沒有證據(jù)表明成體干細(xì)胞是多能干細(xì)胞成體干細(xì)胞稀少，難以識別與純化，也難以在培養(yǎng)條件下在未分化狀態(tài)保持長時間增殖，或能夠保持長時間增殖時，又不定向分化。

當(dāng)前74頁，總共108頁。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

（Mesenchymalstemcells,MSC）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，是骨髓中除造血細(xì)胞以外的中胚層來源的細(xì)胞，其細(xì)胞特性穩(wěn)定，在連續(xù)傳代培養(yǎng)和凍存后仍具有多向分化潛能。當(dāng)前75頁，總共108頁。是干細(xì)胞的一種，具有干細(xì)胞的共性，即自我更新及多向分化的能力。最初是由AlexanderFriedenstein發(fā)現(xiàn)，且證明其在體外分化成為硬骨骼及脂肪細(xì)胞，后續(xù)有其他的研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，此類干細(xì)胞更可以分化成為肝臟、軟骨、肌肉等組織細(xì)胞，2002年一月由美國明尼蘇達(dá)大學(xué)(UniversityofMinnestoa)研究人員發(fā)表的成果，發(fā)現(xiàn)更可以分化成為神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞。當(dāng)前76頁，總共108頁。在特定的誘導(dǎo)條件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為間充質(zhì)組織中的各類細(xì)胞，包括：骨、軟骨、脂肪、肌腱、韌帶等細(xì)胞。當(dāng)前77頁，總共108頁。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：特點

①可經(jīng)誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化，并能分泌特異性Ⅱ型膠原基質(zhì)，因此可望成為工程化軟骨的種子細(xì)胞；②分化為肌細(xì)胞，可能成為肌萎縮、肌營養(yǎng)不良時促進(jìn)肌組織再生的靶細(xì)胞；

當(dāng)前78頁，總共108頁。③與基因治療結(jié)合，可強化治療效果，對某些基因突變所致的遺傳性疾?。虎芸煞蛛x其自體的間充質(zhì)干細(xì)胞，體外進(jìn)行改造，敲除突變基因，導(dǎo)入正?；颍缓笾匦螺斎塍w內(nèi)，既糾正了遺傳缺陷，又避免發(fā)生移植反應(yīng)。當(dāng)前79頁，總共108頁。原代培養(yǎng)15天的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（4倍）當(dāng)前80頁，總共108頁。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代后經(jīng)過14天誘導(dǎo)分化形成的成骨細(xì)胞堿性磷酸酶陽性呈紫紅色40X當(dāng)前81頁，總共108頁。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代后經(jīng)過14天誘導(dǎo)分化形成的脂肪細(xì)胞紅油染色陽性40X當(dāng)前82頁，總共108頁。BMSCs優(yōu)點：BMSCs易于提取、分體、純化及擴(kuò)增，適合作基因治療的載體細(xì)胞。患者可以用自己的干細(xì)胞治療疾病，從而克服了移植排斥反應(yīng)。另外，MSCs具有可植入性，在特定的條件下還可分化為骨、軟骨、肌肉等組織細(xì)胞，是多種疾病基因治療的理想種子細(xì)胞。當(dāng)前83頁，總共108頁。另外，BMSCs具有極強的自我復(fù)制能力和多向分化潛能，來源廣泛，易于獲取，且具有低免疫原性，應(yīng)用方便。當(dāng)前84頁，總共108頁。BMSCs缺點：BMSCs具有體外易衰老等缺點，BMSCs傳代至6~7代后細(xì)胞生長逐漸緩慢，呈現(xiàn)衰老現(xiàn)象，故細(xì)胞存在數(shù)量不足、體外擴(kuò)增困難、體外傳代、保存及復(fù)蘇后增殖及分化能力下降等問題，嚴(yán)重影響其進(jìn)一步廣泛研究及臨床應(yīng)用。當(dāng)前85頁，總共108頁。永生化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞現(xiàn)BMSCs具有體外易衰老等缺點，通過基因工程方法，使BMSCs傳代次數(shù)的增加、仍可保持較好的活性，該類BMSCs稱為永生化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。當(dāng)前86頁，總共108頁。細(xì)胞永生化機制：

M1-M2理論:細(xì)胞經(jīng)多次分裂后,在腫瘤抑制因子p53和Rb作用下,細(xì)胞進(jìn)入M1期,開始衰老。細(xì)胞經(jīng)過20～30PDs后,進(jìn)入M2期凋亡,只有罕見的細(xì)胞在一些因素影響下,端粒酶被激活,以它自身RNA為模板不斷合成端粒DNA來補充和延長端粒有限長度,以維持端粒長度,恢復(fù)染色體的穩(wěn)定性使細(xì)胞得以逾越M2期,獲得無限分裂和增殖的能力,發(fā)生永生化。ShayJW,WrightWE,WerbinH.Definingthemolecularmechanismsofhumancellimmortalization[J].BiochimBiophysActa,1991,1072(1):127.當(dāng)前87頁，總共108頁。永生化BMSCs研究方法：通過質(zhì)粒pCMVSV40T／PUR導(dǎo)入大鼠BMSCs，建立永生化BMSCs．在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；采用檢測堿性磷酸酶的活性。采用裸鼠皮下接種實驗檢測細(xì)胞的致瘤性；當(dāng)前88頁，總共108頁。永生化BMSCs特點：未導(dǎo)入質(zhì)粒的BMSCs培養(yǎng)至l5代后細(xì)胞不能繼續(xù)傳代，呈明顯衰老跡象。而永生化BMSCs培養(yǎng)至15代后仍可保持較好的活性，永生化BMSCs隨著傳代次數(shù)的增加其形態(tài)未見明顯改變，細(xì)胞傳代至15代時，細(xì)胞增長速度無減慢趨勢永生化BMSCs具有明顯接觸抑制當(dāng)前89頁，總共108頁。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)永生化BMSCs細(xì)胞間仍存在接觸抑制，且通過裸鼠皮下注射永生化BMSCs后，觀察4wk后，未見瘤體的出現(xiàn)，表明細(xì)胞為良性細(xì)胞可能性大，且無明顯成瘤性。當(dāng)前90頁，總共108頁。

A:經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后15代的BMSCs

B:未轉(zhuǎn)染的4代的BMSCsC:未轉(zhuǎn)染的15代的BMSCs當(dāng)前91頁，總共108頁。成骨誘導(dǎo)4wk后的永生化BMSCs堿性磷酸